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研究蛋白质与DNA相互作用的方法 肖睿璟 xrj7619@ 主要内容 第一部分 背景知识 第二部分 凝胶电泳迁移率改变分析 第三部分 DNaseⅠ足迹法 第四部分 染色质免疫沉淀分析实验 第一部分 背景知识 蛋白质和核酸之间的相互作用，在生物遗传信息的传递与表达、生物功能的实现中发挥重要作用。 在基因的转录调控和DNA修饰等活动中，蛋白质与DNA的相互作用扮演了关键角色。 基因表达: DNA-RNA-蛋白质，是一个十分复杂而有序的过程。 基因表达是众多的反式因子和顺式作用元件之间相互作用的结果。 基因表达的调控是细胞对外部或内部的刺激发生应答的方式，这涉及到基因组 DNA和一系列结合蛋白的相互作用。 不同生理条件下特异性的基因转录调控常常依赖于不同的反式作用因子与顺式作用元件的特异性结合。 背景知识 阐明真核基因表达机制的基本途径：研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用。 背景知识 研究蛋白质与DNA相互作用的方法： 1、凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA） 2、DNaseⅠ足迹法（foot printing） 3、染色质免疫沉淀实验 （ChIP） 染色质、染色体。 原核：裸露DNA；真核：脱氧核糖核酸(DNA)：组蛋白=1：1组成，另有RNA和非组蛋白。 染色体的基本结构单位：核小体，由DNA和组蛋白(histone)构成。 组蛋白密码 是一种新的调节机制，其信息存在于组蛋白的修饰等过程中：包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。 组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，从而改变染色质结构和活性。 组蛋白磷酸化修饰在细胞有丝分裂和凋亡过程中，能调控蛋白质复合体向染色质集结。 背景知识 研究蛋白质与DNA相互作用的方法： 1、凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA） 2、DNaseⅠ足迹法（foot printing） 3、染色质免疫沉淀实验 （CHIP） 第二部分 凝胶电泳迁移率改变分析 原 理 凝胶电泳的电场作用下，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快。 步 骤 标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，再放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白 。 1、探针： 32P同位素：放射性、半衰期14天。 地高辛标记：灵敏度弱，信号不行。 生物素标记：配合化学发光技术， 广泛应用。 -20℃保存，立即使用，不超过1-2星期。 2、蛋白样品： 材料：细胞—纯度高；组织—杂蛋白。 用专用核蛋白抽提试剂。 核蛋白的浓度：1μg/μl以上。 蛋白样品用量: 一般2-20μg。 应 用 应 用 EMSA特异性好，是研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，常用来鉴定其他方法筛选出的结果。 EMSA结果举例 第三部分 DNaseⅠ足迹法 原 理 蛋白质结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”。 步 骤 将待测双链DNA片段中一条单链的一 端选择性地进行末端标记。 加入恰当浓度的DNase Ⅰ进行酶切。 再经变性电泳分离和放射自显影。 结 果 无蛋白结合的DNA样本： 相差一个核苷酸为梯度的DNA条带； 有蛋白结合的DNA样本： DNA梯度条带在相应于DNA结合蛋白的结合区域中断，形成一空白区域。 应 用 DNaseⅠ足迹法不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。 DNA footprint assay DNA footprint assay 第四部分 染色质免疫沉淀实验 ChIP 原 理 研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。 它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。 原 理 生理状态下DNA与蛋白质交联。 超声或酶处理将染色质切为小片段，利用抗原抗体特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。 再对DNA进行鉴定检测。 操作步骤 即在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质-DNA复合物。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。 注意： 1、细胞状况好：75%-80%；106个/管。 2、甲醛终浓度为1%