06 微生物农药（讲义6）.pptVIP

微生物农药的生物技术 化学杀虫剂的副作用 对人畜和天敌有毒害 造成环境污染、破坏生态平衡 害虫较易产生抗（耐）药性 可通过孢子循环侵染 急待解决的问题 击倒害虫的时间较长； 贮藏寿命短 对环境条件，尤其是湿度，要求高； 昆虫病原真菌穿透寄主外壳示意图（Adopted from Charnley et al.) CDEP-1与球孢白僵菌Pr1、金龟子绿僵菌Pr1、蛋白酶K的氨基酸同源性比较 Bbchit1是从昆虫病原真菌中克隆的新几丁质酶基因 1. 加强真菌杀虫剂的剂型研究； 基因工程改良 Strategies 杀虫真菌的基因工程 构建了抗除草剂基因为选择标记的新型真菌表达载体 Control Transformants 建立了根癌农杆菌介导的转化技术，其效率比PEG法高600倍左右 根癌农杆菌介导法与PEG-CaCl2法比较 Control (Minus DNA) + DNA Inoculation Incubation Remove cell wall Add DNA Regeneration selection A.tumefaciens Fungal spores Co-culture Selection 以原生质体为受体的真菌遗传转化 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化 基因工程技术改造杀虫真菌 1、提高杀虫真菌击倒害虫的速度； 2、改变杀虫真菌的寄主范围。 从如下4个方面提高的杀虫速度 1、加快孢子萌发和侵染 结构形成的速度； 2、缩短穿透昆虫体壁的 时间； 3、提高削弱寄主免疫力 的能力；通过表达毒素）； 4、加快吸收能量物质的速度， 以破坏寄主的生理活动。 杀虫真菌主要通过机械压力和 水解酶的水解作用降解昆虫体壁 与昆虫体壁成分相对应，杀虫真菌在穿透昆虫体壁时产生蛋白酶、几丁酶和脂酶等水解酶. 金龟子绿僵菌降解昆虫体壁蛋白酶 Pr1类蛋白酶 共有11个基因 细菌类Pr1，包含Pr1C 蛋白酶K类，有Pr1A, Pr1B, Pr1G, Pr1I and Pr1K 胞外类Pr1，Pr1D, Pr1E, Pr1F and Pr1J 胞内类Pr1，Pr1H Pr2类蛋白酶 组成型表达Pr1a显著提高 金龟子绿僵菌的毒力 引自 St.leger. et.al， 1996. 未处理 野生菌株 空载转化 转化菌株 以菜粉蝶3龄幼虫为试虫，在107个孢子/mL的浓度下，CC2杀虫时间缩短了22.3%，取食量降低了18.2%。因此，CDEP-1在球孢白僵菌感染寄主的过程中同样起重要作用。 高效表达蛋白酶基因CDEP-1 改造球孢白僵菌 昆虫体壁主要几丁质和填充在其中的蛋白质组成，昆虫病源真菌的首先分泌蛋白酶降解蛋白质，露出几丁质，诱导几丁质酶的产生。 杀虫真菌的几丁质酶基因 金龟子绿僵菌：CHI42、CHI11、CHI2、CHI3和CHIA。 黄绿绿僵菌：CHI1 球孢白僵菌：Bbchit1、Bbchit2 St.Leger等人通过高效表达几丁质酶基因CHIT42未能提高金龟子绿僵菌的毒力 高效表达Bbchit1基因也可提高 球孢白僵菌的毒力 以桃蚜为试虫时，与野生型菌株相比，高效表达Bbchit1的重组菌株gBbchit1杀虫时间减少了19.2% 昆虫体壁主要几丁质和填充在其中的蛋白质组成，昆虫病源真菌的首先分泌蛋白酶降解蛋白质，露出几丁质，诱导几丁质酶的产生 组成性表达CDEP-1和Bbchit1的双价载体 CDEP-1和Bbchit1同时组成性表达分析 菌株 Bb0062-15 CG1 CG3 CG5 CG7 CG9 CG15 Pr1活性（U） 0.00?0.07 15.4?0.02 10.4?0.02 17.0?0.04 15.0?0.02 12.1?0.06 13.2?0.05 几丁质酶活性（mU） 0.00?0.1 0.00?0.3 0.00?0.4 395?0.5 130?0.9 0.00?0.2 0.00?0.3 * * SWAU Biotechnology Research Center 方卫国 I hate locust ! 据FAO（Food and Agriculture Organization ）统计 全世界农林业中由病虫害、杂草危害造成的损失占总产