基因转移与RNA干扰-2007.pptVIP

基因转移/GENE TRANSFERRNA干扰/RNAi 中国协和医科大学 基础医学院 韩代书 基本概念 方法原理 技术要点 实际应用 应 用 1. 研究基因的功能 2. 研究基因的表达调控机理 3. 表达调控元件的结构 4. 大量生产基因产物 5. 生物品种的改良 6. 疾病治疗 基因转移 基因转移(Gene transfer)？ 通过不同途径把外源基因转移到宿主细胞中， 并得以表达的过程. 转染(Transfection) 转化(Transformation) 感染（Infection) 转染(Transfection) 把外源基因转移到真核细胞中 主要指哺乳动物细胞 转化(Transformation) 把外源基因转移到原核细胞中的过程， 指细菌中 感染（Infection) 用病毒做载体进行的基因转移. 两个主要因素 受体细胞：接受外源基因的细胞 基因载体（运输工具）：携带目的基因 并将其运送至细胞内 受体细胞 基因转移的主要目的： 研究基因的表达调控及其功能 选择合适的细胞系十分重要 受体细胞应满足以下条件： 受体细胞的条件 1. 细胞本身不应表达要转染的基因: 无法区分内源和外源基因 2. 外源基因能在宿主细胞中表达： 一些基因只能在特定的细胞中被诱导表达， 在另一些细胞中不能被诱导表达。 受体细胞的条件 3. 选择容易被转染的细胞： 容易培养、生长速度快的细胞容易被转染, 成纤维细胞比上皮细胞容易被转染. 受体细胞的条件 4. 两种常用细胞系 COS细胞: 用SV-40基因组转化猴的CV-1细胞 CHO细胞: 中国地鼠卵巢的成纤维细胞 ? 载体的功能 1.为了外源基因的表达：克隆的基因多数为cDNA， 缺乏表达所必需的调控元件.需要重组到带有 这些调控元件的载体上才能有效的表达。 2.为了更有效的进入细胞：载体容易进入细胞。 基因的载体 理想的载体： （1）可以高水平的表达目的基因 （2）可以高效的转移到细胞内 （3）具有高度的安全性（特别是基因治疗） 基因的载体 可以分为两大类： 病毒载体(viral vector) 非病毒载体(non-viral vector) 非病毒载体--质粒 环状双链DNA 具有酶切位点 质 粒 非表达载体(克隆载体): 不含有表达元件, 只用于基因的保存、扩增、序列分析 表达载体: 含有表达元件，分为真核细胞 表达载体和原核细胞表达载体 病毒载体 由于病毒的结构和生物学特性： 感染细胞、可把外源基因重组到病毒内, 通过感染细胞把外源基因转到细胞内. 逆转录病毒 ( Retrovirus) RNA→DNA→Genome 优点：（1）感染效率高，有时可高达100%， （2）可整合到宿主基因组中，稳定表达。 缺点：（1）只感染并整合到分裂细胞， （2）随机整合，可能干扰宿主的基因， 从而引起疾病。 腺病毒 ( Adenovirus) DNA病毒 （1）可以携带大量的外源基因， 感染及表达效率高。 （2）基因不整合到属主细胞的基因组中， 不会引起疾病，但只能瞬间表达。 （3）易受免疫系统的攻击。 腺相关病毒 （Adeno-associated Virus) 感染效率高；携带的基因较少（4.5kb)； 可以整合到基因组中 基因转移的方法 以质粒为载体的基因转移方法 1. DNA-磷酸钙沉淀法 原理： Ca2+、PO4- 和DNA 形成 沉淀颗粒， 可以沉附于细胞的表面, 通过内吞作 用摄取DNA。 适用于贴壁和悬浮培养的细胞。 转染效率低，小于10%。 DNA-磷酸钙沉淀法 影响转染效率的因素： （1）沉淀颗粒的大小，由PH（7.05）控制 （2）沉淀中DNA的量，需高纯度的 DNA（10-50?g） （3）沉淀处理细胞的时间，6-24hr， 因细胞不同而异 2. 脂质体介导的基因转移 原理: 脂质体+DNA → 复合体，DNA被包围在复合体内，通过与细胞的融合或内吞进入细胞 脂质体介导的基因转移 特点: (1) 转染效率高，可大于50% (2) 操作简便 (3) 需要DNA量少，几微克 (4) 脂质体对细胞有毒性