基因工程-克隆载体.pptVIP

chapter 7 真核生物的克隆载体 E. coli克隆适于研究基因结构功能。如果要合成重要的代谢产物，比如胰岛素，那就需要用到其它克隆载体。 1 酵母和其他真菌的载体 酵母除了酿酒和生产面包外，也被用来生产药物。在酵母S. cerevisiae发现了一个2μ m环状的分子。 1.1 2 μ m质粒的选择标记 2 μ m质粒6kb，拷贝数在70-200之间，含有编码蛋白质的基因REP1, REP2。 一般使用编码氨基酸合成的酶作为标记，如LEU2基因编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。 寄主必须是LEU2营养缺陷体。 1.2 酵母附加质粒 来自于2 μ m质粒的载体称为酵母附加载体(YEps)。YEps可含完整的2 μm质粒，也可只含2 μm质粒的复制起点，如YEp13。 很难从转化的重组克隆中将重组DNA分子提取出来。对YEp13不存在问题。 YEp13是一个穿梭质粒，含2 μ m质粒的复制起点和选择基因LEU2, YEp13还包含pBR322的完整序列。 1.3 YEp可以插入酵母的染色体DNA YEp13质粒中LEU2基因可以与染色体上突变的LEU2基因进行重组，将整个质粒插入到酵母染色体内，可以一直保持整合状态，也可以切下来。 1.4 其他类型的克隆载体 酵母整合质粒(YIps)： 酵母复制质粒(YRps)： 1.4 其他类型的克隆载体 酵母整合质粒(YIps)：在细菌质粒含有一个酵母基因。缺少酵母的复制起点。 YIp5，是在pBR322的基础上插入了一个URA3基因，这个基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，是嘧啶合成中的一个酶，可以作为选择标记，选择的方法与LEU2标记相同，YIp不能像质粒一样复制。 1.4 其他类型的克隆载体 酵母复制质粒(YRps)：含有一段包括起始位点在内的染色体DNA, 可以作为独立质粒进行复制。复制起始位点与多个酵母基因距离很近，包括作为选择标记的基因。 YRp7由pBR322与酵母基因TRP1组成，TRP1参与色氨酸的合成，他与起始位点的距离非常近，插入YRp7的酵母DNA片段包括TRP1和复制起始位点。 1.4 其他类型的克隆载体 实验中质粒的选用需要考虑三个因素： 转化频率 拷贝数 稳定性 转化频率: 也就是每μ g的质粒DNA可获得转化子的数目。 YEps可获得10000-100000转化细胞 YRps可产生1000-10000个转化细胞 YIp产量较低，一般少于1000个，如果不是用特殊的程序，只能产生1-10个重组子。 拷贝数 YEps和YRps含有的拷贝数也最多，每个细胞中含有20-50和5-100个 YIps一般只以单个拷贝存在于细胞中 稳定性 YIps能产生稳定的重组子 YRp重组子是非常不稳定的，母细胞中聚集大量的重组分子，但在子代中就可能丢失，YEp也有同样的问题。 1.5人工染色体 染色体的主要组成如下： 着丝点 两个端粒：存在于染色体的末端，使染色体正确的结束复制，防止染色体被外切酶撕咬 复制起始位点 1.5.1 YAC载体的结构和应用 pYAC3是在pBR322基础上插入酵母基因构建而成的。如URA3和TRP1。 携带TRP1的同时也包含一个复制起点 在pYAC3中这一片段扩展到CEN4。TRP1-origin—CEN4片段已经包含了人工染色体组成三部分中的两部分。 1.5.1 YAC载体的结构和应用 第三部分端粒，有两段称为TEL的序列提供。 SUP4，作为插入片段的选择标记基因。 1.5.1 YAC载体的结构和应用 利用pYAC3克隆的策略如下： 载体首先被BamHI和SnaBI酶切将分子切成三块，BamHI片段被去掉，剩下两个臂都以TEL作为末端，另一端是SnaB I位点。 克隆的DNA必须是平端(SnaBI是一个平端酶，识别序列是TACGTA)被连接在两个臂的中间就产生了人工染色体。 利用原生质转化法将人工染色体引入酵母。受体酵母是利用一个双营养缺陷体trp1-ura3。 转化后于基本培养基上培养。插入片段的鉴定可以通过SUP4基因的插入失活，白色的克隆是重组子，红色的不是。 1.5.2 YAC载体的应用 最早人工染色体的目的是研究不同染色体结构和行为。 可作为载体克隆大片段DNA。 某些情况下，YACs可在哺乳动物中表达。 YACs可以克隆600kb的片段，特殊类型可携带1400kb片段，可将人类基因文库的克隆数降至6500个。 一些哺乳动物的基因大于100kb（如人类膀胱纤维基因有250kb）正好在YAC载体的范围之内。 1.6 其它酵母和真菌的载体 2um的附加体质粒只能在少数酵母中复制。 整合质粒YIps，可在生物反应器中生长很长的时间。 现在已经有许多高效的整合