第7章 花粉和花药培养.pptVIP

花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养） 花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养） 花药、花粉培养的意义 1、迅速获得纯合型材料，提高选择效率，缩 短育种年限 2、获得育种中间材料 3、突变体选育 4、体细胞融合 5、获得染色体异附加系和代换系 6、遗传研究 7、遗传工程受体 花药、花粉培养再生途径 花药和花粉培养中，花粉有5种去向： 再生植株途径有2种： 1、经由成愈伤组织再生植株 2、经由胚状体再生植株 7.1花药培养方法 1、外植体的选择 外植体的遗传背景、生理状态和花粉发育时期。 选择花粉发育适宜时期（一般是单核中晚期到双核早期）的花蕾。 镜检花粉发育时期，并根据发育时期与花蕾大小、外观形态和颜色等的相关性，选择适宜的花蕾。 2、材料预处理 取花粉发育适宜的花蕾进行预处理，低温处理一般在3-5℃处理3-10d，高温处理一般在35℃处理1-3d。 为避免花蕾失水，可将花蕾置于内装有浸湿的滤纸的培养皿中进行处理。 3、材料消毒 消毒方法与其它组织消毒 4、接种 尽可能地避免花药受到损伤；接种速度尽量快；注意接种密度。 5、培养 1）基本培养基 因植物不同所用基本培养基不同，MS、N6、B5等。 2）蔗糖浓度 培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般5%—10%。原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。 3）激素 激素种类和浓度对花药和花粉培养很重要。 花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。 确定适宜的激素浓度，以促使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。 4）培养方式 固体培养 液体培养 双层培养 6、植株再生 7、单倍体确定及染色体加倍 单倍体确定方法，可以镜检根尖染色体数，或根据气孔周围保卫细胞的大小来确定。 染色体加倍，用秋水仙素处理。 ①培养阶段：培养基中加入50-250mg/L秋水仙素。 ②移栽后：用0.2%秋水仙素浸泡生长点1-3d，或每日傍晚点滴生长点数滴，进行5-6d。 7.2 花粉培养方法 习惯上，把处于四分体到单核早期的花粉称小孢子。进入单核以后则称为花粉。 材料的选择（一般是四分体到单核早期）、预处理、消毒、培养基以及再生植株的染色体加倍等与花药培养基本相同。 不同之处：花粉分离收集及培养方式 花粉分离收集： 由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法： 1）花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。 2）人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。 3）机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。 释放的花粉粒→ 尼龙网（孔径20—60um）过滤，除去药壁等组织 → 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。 培养方式： 一般以液体培养（花粉密度调至104-105/ml），形成愈伤组织或胚状体后转入固体培养基。 直接培养：直接取新鲜花药的花粉粒进行培养的方法 （培养基中可添加花药提取液）。 预培养：将花药先悬浮培养2-4天（50个花药/5 ml）， 再挤出花粉，经离心洗涤纯化后悬浮培养。 哺育培养：将在合适培养基上培养裂开的花药作为哺 育组织，将预培养的花粉接种在其中的方法。 影响花药和花粉培养的因素 1、基因型 不同基因型的培养难易及植株再生有很大差别。 2、供体植株的生理状态和环境条件 母体植株的年龄和所经历的环境条件如：光周期、光照强度、温度等对以后的花粉离体培养有很大影响。一般田间比温室，幼龄比老龄植株易于培养。 3、花粉发育时期 只有发育到某一时期的花粉对离体刺激才最敏感。 因此选择合适的花粉发育时期的花药很关键，多数植物单核期的花粉培养容易成功。 4、预处理 花粉或花药从植株上取下来直接培养，往往诱导频率极低，采用低温、高温、离心等预处理方法可以促进花粉启动，提高再生频率。 5、培养基成分 基因型不同，所需培养基种类，蔗糖浓度以及添加激素种类和浓度不同。加入活性炭可提高