质粒DNA提取、鉴定(操作)2010-11.pptVIP

质粒DNA提取、鉴定 本次实验包括： 1. 大肠杆菌的扩大培养 2. 菌体收集 3. 菌体裂解、质粒DNA提取、纯化 4. 鉴定 细菌的培养  从-20℃取出菌种，菌液0.2 ml＋10 ml LB培养基（含Amp 50μg/ml) 37 ℃培养过夜。 取6 个1.5 ml Eppendorf管，分别加入细菌 培养液1.4 ml ↓ 9000rpm 2-3min ↓↘弃上清 2. 600 μl STE液依次溶解各管沉淀，合并一管 再用200 μl STE液清洗各管，合并一管 ↓ 9000rpm 2-3min 弃上清，保留菌体 3. 沉淀悬于200 ul溶液I，枪头吹打混匀 ↓ 放置5 min 4. 加入400 ul溶液II，颠倒EP管20～30次（动作轻!！） 放置5 min 5. 加入300 ul溶液III，充分混匀（温和操作） ↓ 10 min 12000rpm 3min ↓↘弃沉淀 6. 将上清转移至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇(540 ul )，颠倒混匀 ↓ 室温5 min 离心12000rpm 10 min ↓↘弃上清 沉淀干燥，室温 10 min ↓ 7. 加TE 500ul溶解沉淀 8. 加入等体积饱和酚，振摇1min，充分混匀 ↓ 12000rpm 5min 9. 将上层水相转移至另一Eppendorf管中，用等体积氯仿-异戊醇抽提，振摇1min，充分混匀 ↓ 12000rpm 5min 10. 将上层水相转移至另一Eppendorf管中，加入预冷的2.5倍体积无水乙醇 ↓ -20℃ 30 min 离心 12000rpm 15min ↓ ↘弃上清 沉淀干燥 ↓ 11. 加入TE 50ul,溶解沉淀 （反复吹打至 完全溶解） 鉴定质粒 提取质粒、单酶切、双酶切样本一起电泳，与marker比较，估计质粒大小。 单酶切： HindⅢ将质粒酶切 双酶切： HindⅢ和BamH Ⅰ,CD基因1.2kb切出 鉴定 (质粒分子量、纯度及是否含有所需要DNA段) (一) 酶解 双酶切体系： 单酶切体系： sample　 5 ul　　 sample　 5ul BamH Ⅰ 1 ul HindⅢ 1 ul HindⅢ 1 ul 10×buffer 2.5 ul 10×buffer 2.5 ul 　 ddH2O　 15.5 ul ddH2O　 16.5 ul 混匀，离心(瞬时)，37℃　1ｈ 13. DNA浓度测定 溴乙锭荧光法(半定量法，一大组/板) （1）制备1 %琼脂糖凝胶板（塑料平皿中）待用。 （2）点样： 标准ＤＮＡ溶液 （Marker：老师加） 1.0 0.5 0.25 0.1 0.05 0.025 0.01 ug/ul 分别吸取1ul点于制好的琼脂糖平板上 样品： 吸取1ul，滴加于琼脂板上。 (3) 浓度测定： 避光，１小时后，在