实验动物现代新技术（一）.pptVIP

实验动物胚胎工程技术 实验动物胚胎工程技术主要是指从生殖细胞至囊胚的体外操作技术，包括： 人工授精、同期发情、超数排卵、胚胎培养、胚胎保存、胚胎移植、胚胎分割、胚胎嵌合、体外授精、显微授精、性别控制、基因转移、胚胎干细胞、细胞核移植、卵母细胞激活与孤雌发育等。 第一节 实验动物胚胎工程技术原理 一、试管动物的培育程序 试管动物的培育程序 精子采集 超数排卵 假孕动物准备 ↓ ↓ 精子获能 卵子采集 体外受精 胚胎移植 胚胎培养 产 仔 二、超数排卵 超数排卵——指哺乳动物经过外源激素处理，卵巢一次排出超常数几倍到十几倍成熟卵子的现象。 三、体外受精 体外受精——在人工创造的受精条件下，使精子与卵子在体外结合成受精卵的过程。 四、胚胎移植 胚胎移植——用人工方法将受精卵或早期胚胎移植到假孕动物的输卵管或子宫的过程。 五、胚胎培养 胚胎培养——在体外创造类似于动物体内条件的环境，使胚胎在体外得到正常发育。 六、胚胎冷冻保存 胚胎冷冻保存技术是指在低温条件下利用低温保护剂保存胚胎的一门技术。 （一）胚胎冷冻保存的机制 动物胚胎的冷冻保存原理 低温能够抑制生物机体的生物化学活动，降低了胚胎内的变质反应速度。采用低温保护剂，可以避免或减少胚胎冷冻过程中所发生的物理和化学损伤。并且温度越低，保存时间就越长。 低温损伤的两因素理论 即溶液效应而造成的化学损伤和细胞内结冰而造成的物理损伤。 低温损伤的两因素理论 溶液效应：由于冷却速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液浓度提高，胞内水分大量渗出，导致细胞的强烈收缩和细胞处于高浓度的溶液中时间过长，从而造成化学损伤。 细胞内结冰：由于冷却速度过快，胞内水分来不及通过细胞膜向外渗出，胞内溶液过冷而结冰，从而造成物理损伤。同样，在复温(解冷)过程中，如果复温速率不当也可能引起细胞内结冰(重结冰)而损伤。 （二）胚胎冷冻保存方法 包括慢速冷冻法、快速冷冻法、一步冷冻法、直接移植冷冻法、玻璃化冷冻法等。 一般步骤：①抗冻保护剂的添加。②植冰和降温速度；③胚胎复温解冻。④抗冻保护剂的去除。 1、慢速冷冻法 ①将胚胎放在含有抗冻剂(1 moL／L的DMSO溶液)的溶液中进行预处理。 ②用程序降温仪将上述预处理的胚胎连同溶液以较慢的速度(＜l℃／min）降温。 ③降到一定温度时(－80℃)，再快速降温至液氮温度(－196℃)，投入液氮中保存。 ④需要时，从液氮中取出胚胎进行解冻。解冻时需要慢速复温(4-25℃／min)。 ⑤去除抗冻剂。即按相同的浓度梯度，从浓的抗冻剂中移到稀的抗冻剂中。 2、玻璃化冷冻法 ①首先将胚胎在室温下放入25％玻璃化溶液(VS液)中预处理15min。VS液的组成以甘油、DMSO、乙二醇和丙二醇以及蔗糖为主。 ②将预处理后的胚胎放在高浓度(75％-90％)的VS液中保存20-40min。 ③将经过两步抗冻剂处理的胚胎直接投入液氮中保存。玻璃化冷冻保存的胚胎，解冻时则需要快速复温。 七、胚胎分割 用显微术将未着床的早期胚胎一分为二、四或更多，然后分别移植给受体，妊娠产仔，这项技术叫胚胎分割。 八、胚胎嵌合体 将两枚或多枚胚胎细胞聚合共同发育成一个胚胎的技术称为胚胎嵌合这样由两种或两种以上的胚胎细胞所组成的胚胎称为嵌合体。 两种以上不同基因型(如A和B)的受精卵嵌合发育成的个体也称为嵌合体，又称异表型体，表示为A←→B。 该项技术可检测动物胚胎干细胞的全能性，可以克服动物种间杂交的障碍，也可培育器官。 九、胚胎干细胞 胚胎干细胞（embryonic stem cell ，ES）是早期胚胎或原始生长细胞经离体抑制分化筛选出在发育阶段上类似于早期胚胎的内细胞团，具有分化潜能和整倍体核型，既可进行离体培养、扩增、转化和筛选，又可分化成包括生殖系在内的各种组织的全能性细胞。 小鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊及人的ES细胞系已经成功建立。 ES细胞建系的原理是将旱期胚胎（桑堪胚或囊胚）或者是用外科手术法得到的内细胞团或者原始生殖细胞（primordial neim cell，PGCs），与分化抑制物共同培养，使之增殖而又保持未分化状态。这样代代相传。 第二节 试管小鼠和嵌合体小鼠的育成技术 一、试管小鼠的培育 方法步骤 1、小鼠精子采集与获能　　 2、小鼠卵子获取 3、体外受精 4．受精卵培养 5、胚胎移植 二、嵌合体小鼠的培育 嵌合体制作两种方法： ①聚合法，把8细胞至桑椹胚前期的胚胎去掉透明带后，将两个胚胎的卵裂球聚合在一起，形成一个胚