第三章_细胞破碎.pptVIP

* 1 酶溶法 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细 胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击 等方法破坏细胞膜。 1）外加酶法 常用的溶酶 溶菌酶、 β-1，3-葡聚糖酶、 β-1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等 * 酶解法的特点 优点： 发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整 缺点： 溶酶价格高， 溶酶法通用性差 产物抑制的存在。 * 2）自溶作用 利用生物体自身产生的酶来溶胞，而 不需外加其他的酶。 缺点： 易引起所需蛋白质的变性，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 * 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 2 化学渗透法 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 * 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。 成本低，反应激烈，不具选择性。 （1）酸、碱处理法 * 常用的表面活性剂： 离子型：如SDS（阴离子型）； 非离子型：如Triton X-100等。 （2）表面活性剂 表面活性剂能使膜的通透性增加或溶解。 * 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3）有机溶剂 （4）EDTA螯合剂 处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。 * 通用性差； 时间长，效率低； 有些化学试剂有毒。 给后产物的纯化带来困难。 化学渗透法特点： 缺点 对产物释放有一定的选择性； 细胞碎片少，易于固液分离和进一步提取。 优点 * 3 物理法 渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法 * 1）渗透压冲击法 利用渗透压的变化（高压 低压）使细胞破碎。 适用于细胞壁较脆弱的细胞。 适合于实验室规模。 * 2）冻结-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约-15℃）， 然后在室温中融化，反复多次而达到 破壁作用。 适用于细胞壁较脆弱的菌体。 * 使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。 3）干燥法 气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥 * 选择破碎方法的依据： 细胞处理量； 细胞壁强度和结构； 目标产物对破碎条件的敏感性； 破碎程度； 目标产物的选择性释放 * 选择性释放目标产物的一般原则 ⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 (2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件 更加温和，在相同的目标产物释放率条 件下，降低细胞的破碎程度。 * 破碎率的测定 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。 直接测定法 目的产物测定法 导电率测定法 采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。 * 破碎技术的研究方向 多种破碎方法相结合 化学法、酶法、机械法相结合。 酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合 有机溶剂与冻融法、干燥法结合 * 2）与上游过程相结合 在发酵培养过程中，改变培养基成分或操作等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 用基因工程的方法对菌种进行改造。 * 三、基因工程包涵体的纯化 胞外分泌型表达： 胞内表达： 胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收集上清→纯化 胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。 不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。 离心,收集液相→浓缩→纯化。 * 外源蛋白在大肠杆菌中的积累 蛋白 产物占菌体总蛋白 外源蛋白的积累 人胰岛素 50% 形成包涵体 β -丙酰胺酶 20% 在细胞间区 γ-人体干扰素 25% 形成包涵体 凝乳酶原 形成包涵体 牛生长激素 30% 形成包涵体 β -内酰胺酶 形成间区包涵体 人胰岛素原 5%~26% 形成包涵体 * 包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。没有生物活性。 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的高水平表达。 高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？ 蛋白过量积聚； ②蛋白质自身不稳定。 包涵体的构成 * 基因工程包涵体的纯化方法 收集菌体细胞 细胞破碎 包涵体的洗涤 目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性 * 1）包涵体的洗涤 细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性-去杂 洗涤剂