差异显示技术及其应用.ppt

mRNA差异显示技术(mRNA differential display PCR, mRNA DD-PCR)是由Peng Liang等人在1992年建立的筛选基因差异表达的有效方法。它是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。每一种组织细胞(包括同一组织细胞经过不同的处理)都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱，即特异的RNA指纹图谱。 1．原理 差异基因表达是细胞分化的基础。正是这些基因在细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期的调节、细胞衰老和死亡等。mRNA DD-PCR技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。不同的组织/细胞或遗传背景相同的同一组织/细胞经过不同的处理后，提取各自的总RNA，进行mRNA的逆转录合成 cDNA。进行逆转录时3端引物采用oligo(dT)l2MN，其中M为A、C、G中的任何一种，N为A、C、G或T中的任何一种，所以共有12种oligo(dT)l2MN引物。其申M称为锚定引物，起增大引物Tm值的作用。N称为分类碱基，对逆转录进行归类。 用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的逆转录反应，从而使逆转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类(目前较为流行的是进行4种归类，即3端引物采用oligo(dT)12M, M为A、C、G中的任何一种)。5端引物采用20条由10个碱基组成的随机引物。对每一类cDNA进行随机引物和逆转录引物PCR扩增，通过对不同的组织/细胞或经不同处理的同一组织 /细胞的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物的凝胶电泳分析，从而反映出不同样品的基因在时间和空间上的组织特异性表达。简述其基本原理，就是将基因背景相同的2个或几个细胞系或组织mRNA逆转录成cDNA，用不同引物对，进行PCR扩增，扩增时加人同位素标记的核苷酸。用测序胶电泳分离PCR产物，经放射自显影即可找到被扩增的差异表达的基因。 2．实验流程 图略 组织样品总RNA的提取→去除RNA样品中的微量DNA→设计引物序列→逆转录归类反应体系的建立→PCR选择性扩增→mRNA DD-PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳→差异表达条带的回收→回收条带的再次扩增→二次扩增产物的克隆、测序和GenBank查询→Northern Blot和 Dot Blot杂交。 3．特点 通常情况下，在某一细胞中或某一个关键的发育时间点上有15000种以上的基因在表达。如此众多种类的mRNA逆转录产物经PCR选择性扩增后其类型依然众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离。因而需要对逆转录产物的cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。该方法就具有快速、灵敏和重复性好等优点。 4．应用 mRNA DD-PCR技术是筛选和克隆差异表达基因的一种快速而行之有效的方法。 第二节 扣除杂交技术　　扣除杂交法的本质是除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。　　下面以T 细胞受体（T-cell receptor，TCR；有时亦称之为T细胞抗原受体）编码工因的分离为例子，说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。　　 TCR基因只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。从T细胞mRNA制备来的单链cDNA，同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温，所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子（约占98%），都能与B细胞的mRNA退火形成DNA-RNA杂交分子，而不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA（约占2%），由于B细胞中没有相应的mRNA，仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱（hydroxylapatite column），于是DNA-RNA杂交杂分便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。如此回收入到的T细胞特异的cDNA被转变为双链cDNA之后，与适当的λ噬菌体载体重组并转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞持cDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备扣除的cDNA探针，即被B细胞mRNA杂交扣除了的T细胞特异的cDNA探针，筛选文库，结果成功地分离到了T细胞的TCR基因。　　扣除杂交法同样也可以用来分离缺失突变基因 第四节 抑制性衰减杂交技术　　 SSH 即抑制消减杂交技术是由Diatchenko 等于1996 年以m RNA 差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。它主要基于最近出现的抑制PCR , 并结合标准化(normaliza