临床检验免疫学 发光免疫和金免疫.pptVIP

发光免疫技术 发光免疫技术 （luminescence immuno一technique） 是将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种超微量免疫分析技术。 根据发光免疫技术中发光标志物的不同，可分为三种类型： 1. 化学发光免疫分析 (chemiluminescence immune assay, CLIA) 2. 化学发光酶免疫分析 (luminescence enzyme immunoassay, LEIA) 3. 生物发光免疫分析 (bioluminescence immunoassay, BLIA) 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行, 在过氧化物酶及活性氧[ 过氧化阴离子(O2- ) , 单线态氧(1O2 ) , 羟自由基(OH-) , 过氧化氢(H2O2) ]存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。 早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) , 但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(NaOH2H2O2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM 半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。 吖啶酯类化合物通过起动发光试剂(NaOH2H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。 吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 化学发光酶免疫分析 ( chemiluminescent enzyme immunoassay, CLEIA ) 属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同。 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 1. HRP 标记的CLE IA 2. 增强发光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme immunoassay, ELEIA ) ?????? 在发光系统中加入增强发光剂, 如对二碘苯酚等, 以增强发光信号, 并在较长时间内保持稳定, 便于重复测量, 从而提高分析灵敏度和准确性。 3　AL P 标记的CL E IA ?????? 所用底物为环1, 22二氧乙烷衍生物, 这是一类很有前途的发光底物 , 用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基, 其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团, 在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AM PPD , 中文名为: 32(2’2 螺金刚烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22环二氧乙烷)。 在碱性磷酸酶(ALP) 作用下, 磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AM PD (半寿期为2～ 30m in) , 此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态时产生470nm 的光, 可持续几十分钟。AM PPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物, 可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10- 15mol/L 。 胶体金的制备 制备方法胶体金的制备多采用还原法 还原材料:氯金酸（HAuC14） 常用还原剂: 柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。 最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。 胶体金制备方法 配制0.01％ HAuC14溶液 煮沸 加入1％柠檬酸三钠 煮沸15min,至溶液稳定成红色。 冷却后恢复至原体积。 应用 上述两种试验的共同特点是： 1. 简便、快速、单份测定、可立等结果，除试剂外无需任何仪器设备，且试剂稳定。因此特别适用于急诊检验。 2. 但这类试验不能准确定量，所以主要限于检测正常体液中不存在的物质（例如诊断传染病中的抗原或抗体）以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）。 银染色过程 TBS浸洗三次,3mi