肠道菌群多样性分析实验设计.pdfVIP

实验设计 人体肠道菌群多样性分析 高通量测序技术 （Illumina Miseq 2*300） 微基生物科技（上海）有限公司 微基生物——您自己的微生态研究团队 1 实验技术路线 样本 样本 样本 DNA MiSeq 生物 采集和处理 寄送 DNA 抽提 文库构建 高通量测序 信息分析 2 可检测的微生物 对于肠道菌群多检测样本中的细菌 （用16S rRNA 基因进行检测）；对于粪 便样本中的真菌、产甲烷菌、放线菌，我们也进行过检测，但这3 种微生物能否 检出，取决于样本自身的状况。 3 具体实验流程 3.1 受试者的选择 根据实验的目的，确定选择受试者的条件，如性别、年龄、体重、身体健康 状况、有无特殊疾病等因素，文献中报道过使用抗生素可以将肠道菌群杀死，受 试者在3 个月内不要服用抗生素。根据考虑的因素，选择符合条件的受试者。向 受试者交代实验的目的、过程、风险、收益及退出机制等，确保受试者理解全部 实验内容，待受试者签订知情同意书后开始取样。 性别：考虑男女性别； 年龄：建议选择该疾病高发期的年龄，比如某种疾病在40 岁左右属于高发期， 那么受试者的年龄都选择40 岁左右。 数量：如果仅作小试，建议选择某一年龄段的、男受试者10 人、女受试者10 人。 有无特殊疾病：不同疾病对肠道菌群的影响不一样，建议选择除该疾病外，无其 他特殊疾病的受试者，尽量让受试者的身体状况保持一致。 3.2 粪便样本采集 在用药前1 天，采集选定的10 名男性受试者和10 名女性受试者的新鲜粪便。 微基生物科技（上海）有限公司 2 / 7 微基生物——您自己的微生态研究团队 人体对不同药的吸收时间不同，因此建议参考该药的吸收时间，确定用药后粪便 样本的采集时间。不同实验中采样的时间不一样，可以在用药后的1、2、3、4 、 5、6、7 天分别进行采样，可以在用药后的1、3、5、7 天中进行采样。确定采 样时间后，采集上述10 名男性受试者和10 名女性受试者的新鲜粪便。 让受试者将粪便排泄到干净的容器中，尽量避免尿液、马桶壁等对粪便样本 的污染。粪便要采集新鲜的，建议采集排泄中后部的粪便，并尽量挖取中部内侧 的粪便作为样本。用无菌勺对新鲜的粪便进行挖取，将粪便样本放入无菌保存管 中，每个样本需1g 左右。记录好每个样品的编号。采集好的样本立刻放入-80 ℃ 冰箱进行低温保存。 若无法实现低温保存，可以采用微基生物研发的粪便微生物DNA 常温保存 液，可以实现粪便微生物样本的常温保存和运输。 3.3 样本保存和寄送 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰+冰袋），以保证运输过程中的低温条 件（干冰的挥发消耗量约为3 公斤/天）。在打包时先放入足量的干冰，之后用冰 袋填充泡沫盒中间的空隙。为了保持较好的低温环境，建议采用厚一点的泡沫盒。 3.4 样本DNA 抽提 收到样本后，我们会对样本进行DNA 抽提。针对粪便样本，我们采用的是 进口的DNA 抽提试剂盒——QIAamp DNA Stool Mini Kit 。之后抽提的DNA 的 总量、浓度等进行质控，质控合格后进行文库构建、测序等后续实验。 3.5 DNA 文库构建 DNA 文库构建主要包括4 个步骤： PCR 引物设计-PCR 扩增-PCR 产物 的凝胶回收和检测-样本DNA 的定量。 3.5.1 PCR 引物的设计 根据Illumina MiSeq 高通量双向测序的要求，设计PCR 融合引物。PCR 产物 包含待测区域、测序引物、特异