第六章-5+基因治疗-12.17.pptVIP

五、基因治疗 （一）基因治疗的概念 基因治疗的必要条件 外源基因可有效导入靶细胞； （二）基因治疗的发展史 指将致病基因的异常碱基进行纠正， 而正常部分予以保留。 1）反义RNA技术 2）核酶技术 4）三链DNA技术 （六）基因治疗的现状和问题 基因治疗中有待解决的问题 将某些细胞因子基因（如IL-2、IL-4、TNF-?、INF-?、GM-CSF）转染肿瘤细胞，可使其表达活性细胞因子。 转染后的肿瘤细胞体内致瘤性丧失，动物预接种后，对再接种的同种肿瘤有抵抗作用。 1）基因修饰肿瘤细胞“疫苗”疗法 2）基因修饰TIL的过继免疫疗法 将某些细胞因子基因（如IL-2、TNF-?等）导入TIL，活化后的TIL具有显著抗自身肿瘤作用，回输体内后有聚集于肿瘤部位的倾向，细胞因子在肿瘤局部表达量增加，避免全身大剂量使用细胞因子引起的毒副反应。 将MHC I类抗原基因经体内导入肿瘤细胞内，增加其免疫原性，激活机体抗肿瘤免疫反应。 3）免疫增强基因疗法 间接体内疗法 (ex vivo) （四）基因治疗的实施方式 直接体内疗法 (in vivo) 1）直接体内疗法 (in vivo)： 将外源基因装配于合适的载体，直接导入有关的组织器官，使其进入相应的细胞并表达。 载体 目的基因 in vivo 2）间接体内疗法 (ex vivo)： 将携带外源基因的载体导入自体细胞，体外扩增后再回输体内，细胞在体内表达相应产物。 ex vivo 靶细胞 对某特定疾病进行基因治疗，首先选择和获得相应的目的基因和合适的受体细胞，同时构建载体，再通过适当的转移技术，将目的基因导入受体细胞。 （五）基因治疗的步骤 基因治疗的基本步骤 治疗性基因的选择 基因载体的选择 靶细胞的选择 基因转移 外源基因表达的筛选 回输体内 Normal Gene or RNA Gene Carrier Target Cell Key Points of Gene Therapy 1995年以后，对基因治疗的态度开始变得慎重，但对基因治疗的研究并未冷却，研究势头不是减弱，而是目标更明确、组织更严密、进展更快速。 3、受体介导反义RNA技术 将多聚阳离子(如多聚赖氨酸)与细胞亲和性配体共价连接后，再通过电荷相互作用与带负电荷的反义RNA结合、将其包围，配体暴露于表面，形成的复合物被含特异性受体的靶细胞吞饮，反义RNA靶向导入靶细胞。 antisense RNA 将去唾液酸血清类粘蛋白(ASGP)与多聚赖氨酸(PL)共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载反义RNA的工具。 ASGP-PL-反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面ASGP受体识别、并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，被逐渐释放出来发挥作用。 例如： 2、反义RNA是被保护的，与周围环境间存在多聚赖氨酸保护层，可抵抗环境中RNase的降解作用。 受体介导反义RNA技术的优点： 1、转移十分专一，效率高； 3、用硫代磷酸核苷代替通常的核苷酸，可增强反义RNA的抗降解作用。 4、设计有核酶活性的反义RNA，不仅可阻断靶mRNA翻译，还能通过核酶切割靶mRNA，促进其降解。 1983年，美国Cech和Altmann发现并鉴定了一类具有酶催化作用的核苷酸片断，称为核酶。这一发现使酶的概念从蛋白领域扩展到核酸领域。 核酶(ribozyme)： 原理： 核酶的特异性序列通过互补碱基对形成，识别并结合特异性靶RNA，破坏靶RNA。 核酶：是一类本身具有酶剪切活性的RNA，能序列特异地切割靶RNA。 核酶的设计： 1）靶RNA分子： 无二级结构，具有核酶切割位点GUN，能与核酶分子结合，组成酶活性结构域。 Recognition sequences 2）核酶分子： 由三部分组成，中间是保守序列（组成酶活性结构域），两端是引导序列（识别和结合靶RNA分子）。 Recognition sequences 核酶的作用机制： 核酶的优点： 1、结构稳定 与反义RNA相比，核酶具有稳定的空间结构，不易受RNase攻击。 2、可重复使用 核酶在切断mRNA后，可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它mRNA分子。 1）外源导入： 采用脂质体法，将体外转录合成的核酶经脂质体包裹后，导入细胞。 该法导