分离纯化资料(打印版).docVIP

1 在目前基因和基因组时代，你觉得生物大分子的分离纯化还有什么重要意义？ （1）分离大分子，研究其结构与功能， 对于了解生命活动规律有重要意义（2）满足工业生产的需要（3）满足医疗的需要（4）满足基因工程的需要2 生物大分子的分离纯化与一般有机化学中的物质分离纯化相比有什么相同和不同之处？ 首先，通常原料液中目标产物往往比较低，杂质比较多，其中除了含有目标产物外，还含有未转化的底物，所以说生物大分子的分离纯化是相当困难的。其次，生物大分子物质大多是生物活性物质，易受环境因素如温度、PH、金属离子和微生物等影响，甚至失活，必须设计合理的分离过程和操作条件，实现目标产物的快速分离纯化，获得高活性的目标产物。再次，用于药物，食品化妆品的生物产物是与人类生命息息相关的，因此，要求分离纯化过程要除去原料液中的热原及具有免疫原性的异体蛋白质等有害人类健康的物质，并且防止这些物质在分离纯化过程中由外界混入。最后，原料液中常存在与目标分子在结构、构成成分等理化性质上非常相似的分子及异构体，形成常法难于分离的混合物，因此，一般需要选择具有高度选择性的分子识别技术或高效液相色谱技术分离纯化目标产物，同时生物产物的原料成分复杂，需要采用多种分离技术和多个分离步骤完成一个目标产物的分离纯化任务。3 离心技术的基本原理是什么？颗粒在离心管中离心时要受到那几个力的作用？ 原理：将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量，密度，大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不同，由此便可以得到相互间的分离。 受到的力：离心力、介质的摩擦阻力、浮力、重力及重力浮力(均可忽略不计)4 差速沉淀离心的原理时是什么？有什么特点？ 原理：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速率不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。 特点：操作简单，离心后倾斜即可分离上清和沉淀，并可使用容量较大的角式转子。缺点是，分离效果差，不能一次得到纯颗粒（2-3次）壁效应严重。颗粒在离心力过大时间过长情况下变形、聚集而失活，挤压严重。5 与差速沉淀离心相比，区带离心有什么特点？ 此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适用范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。6 什么是差速区带离心法?有什么特点？ 将样品置于平缓的预先制好的密度梯度介质上，进行离心，较大的颗粒将比较小的颗粒更快的沉降。通过梯度介质，形成几个明显的区带（条带）。离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同的沉降速率沿管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚地不连续区带。 特点：①有时间限制，在任一区带到达管底之前必须停止离心。②仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与密度无关。大小相同、密度不同的颗粒（如溶酶体、线粒体和过氧化酶体）不能用本法分离③沉降系数越大，往下沉降的越快，所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上的部分依次出现。从沉降的情况看来，离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底之前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。④区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。7 什么是等密度离心?有什么特点？ 等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度，这种，密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的唯一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于1%就可以用此法分离。 特点：①加样位置不拘；②离心平衡后，区带位置、形状不受时间影响；③梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度；④分离依据是组合间“浮力e”差异，与颗粒大小形状无关；⑤离心力大小，组合颗粒的大小和形状，介质密度梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。 8 离心操作的注意事项有哪些？ 离心机是实验室中极常见的分离工具，通常依其使用目的可分为数种：低速离心机、高速冷冻离心机、超高速真空离心机等；低速又有细胞离心机，以及常见的微量离心机等。使用离心机首重安全，因为离心机失