第三章—核酸.ppt

两类核酸的基本化学组成 二、 碱基 嘧啶碱：尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶 嘌呤碱：腺嘌呤、鸟嘌呤、嘌呤衍生物 修饰碱基：100余种，多数是甲基化的产物 三、核苷酸 核苷酸是核苷的磷酸酯 核苷酸 ＝ 核苷 + 磷酸 核苷中戊糖C2、C3、C5 羟基被磷酸酯化 构成DNA的核苷酸：5’－脱氧核苷酸 构成RNA的核苷酸：5’－核苷酸 一、DNA的结构 一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。 二级结构：两条DNA多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。 三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。 螺旋每圈含10个碱基对，螺距为3.4nm，双螺旋平均直径2nm； 螺旋表面有一条大沟和一条小沟；大沟宽1.2nm ，深0.85nm；小沟宽0.6nm，深0.75nm。 螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持； (三）?DNA的三级结构—超螺旋 DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象； 超螺旋是DNA三级结构的主要形式。 二、RNA的结构 （一）tRNA的结构 70-90b，分子量在25kd左右， 沉降系数4S左右； 有较多稀有碱基（ψ、DHU） 3’末端为…CCA-OH； 5’末端大多为pG…或pC…； 二级结构：三叶草形； 三级结构：倒L形。 tRNA的倒L型三级结构 真核细胞mRNA的一般结构 原核mRNA的结构（多顺反子） 由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成，没有5’帽子和3’polyA； SD序列：5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列； SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补。 一、核酸的酸碱性质 碱基、核苷与核苷酸均能发生两性解离； DNA等电点4-4.5，RNA等电点 2-2.5。 三、核酸的变性、复性及杂交 分子杂交的种类 Southern Blot：DNA-DNA杂交 Northern Blot：DNA-RNA杂交 Western Blot：抗原-抗体进行杂交 原位杂交：活体组织上进行杂交 （一）DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提去除蛋白质，还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3mol/L NaAC-70%乙醇沉淀。 （二）RNA的制备 核蛋白的提取：将细胞破碎制成匀浆，再用0.14mol/L NaCl溶液将细胞质的核糖核蛋白体抽提出来，留下含DNA的细胞核组织，核糖核蛋白可在pH4.5溶液中沉淀析出。 核酸和蛋白质的分离：含水的苯酚能沉淀蛋白质，核酸和多糖则溶于水层。 在特定盐浓度下，水层中的RNA可被异丙醇选择性沉淀得RNA。 （三）核酸的定量 紫外分光光度法、定磷法、定糖法 三、核酸的凝胶电泳 限制酶切图谱 DNA的化学合成 DNA固相合成（亚磷酸三酯法）； 合成方向：3’?5’端； 5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，碱基上氨基用苯甲酸保护； 3’-OH用氨基磷酸化合物活化 5sRNA的二级结构 16sRNA的结构 RNA的功能多样性 参与和控制蛋白质的生物合成； 作用于RNA的转录后加工与修饰； 参与基因表达与细胞功能的调节； 生物催化作用； 遗传信息的加工与进化。 第四节 核酸的理化性质 二、核酸的紫外吸收 核酸在240－290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax= 260nm 鉴定纯度： 纯DNA：A260/A280 = 1.8（1.65-1.85） 纯RNA：A260/A280 = 2.0 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280明显降低。 含量计算 OD260 = 1相当于：50ug/mL双螺旋DNA 40ug/mL单链DNA（或RNA） 20ug/mL寡核苷酸 判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）；在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）。 （一）变性 核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 变性因素：热变性、酸碱变性（pH小于4或大于11）和变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）。 变性后的理化性质：260nm吸收值升高（增色效应）；粘度降低，浮力密度升高；二级结构改变，部分失活。 熔解温度（Tm）： DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在82－95℃之间。 影响DNA的T