血红蛋白的提取与分离 笔记.docVIP

一. 样品处理： 1、红细胞的洗涤： （1）取材：选用哺乳动物的血液来分离血红蛋白。 （2）目的：去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化 （3）过程： 1、采集血样（柠檬酸钠处理） 2、低速短时间离心【500r/min、2min】（速度越高和时间越长， 会使白细胞和淋巴细胞等较重的细胞也一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。 5、缓慢搅拌10分钟，再次低速短时间离心 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。（若仍有黄色可继续) 2、血红蛋白的释放： （1）目的：使红细胞破裂，释放血红蛋白 （2）过程： 3、分离血红蛋白溶液： （1）目的：经离心使血红蛋白与其它杂质分离，便于下一步纯化。 （2）过程：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。 （3）结果：试管中溶液分为4层： 1（最上层）：甲苯层（无色透明）； 2（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 3（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 4（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 （4）分离： 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层， 分液漏斗中静置片刻，分出下层的红色透明液体。 二.粗分离——透析 1、目的：除去样品中分子量较小的杂质。 2、原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 3、方法：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH7.0），透析12小时。 三.纯化 （一）目的：通过凝胶色谱法将相对分子量较大的杂质蛋白质除去。 （二）凝胶色谱操作 1、凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。 2、凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的缓慢装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。 注意： （1）加样 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 3、样品加入与洗脱 ①加样前：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②加样：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端。滴加样品时，：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 ③加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 （2）洗脱 ①洗脱：小心加入磷酸缓冲液，打开下端出口进行洗脱。 ②收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 四.纯度鉴定： ——通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所提取血红蛋白的纯度。 思考下面的问题： 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ （1）观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。 （2）离心速度过高和时间过长