实验二DNA Marker和质粒的制备.pptVIP

DNA Marker 的制备 DNA Marker 的制备 DNA Marker 的制备 DNA Marker 的制备 质粒DNA提取和鉴定 质粒DNA的基本特性 质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型（Stringent control）和松驰控制型(Relaxed control)。 质粒DNA的基本特性 质粒的不相容性（Incompatibility）：利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在 。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。 pET-28a 质粒提取原理 将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。 质粒提取原理 在裂解过程中，细菌蛋白质破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS包盖，当用钾离子取代纳离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可从上清中回收复性的质粒DNA。 质粒提取步骤 取1.5ml摇匀的菌液，室温6000rpm离心5分钟。 倒掉培养基并将离心管倒扣于吸水纸上充分除去残留的液体。 用100ml溶液I充分重悬细胞至管底没有沉淀并且无块状物悬浮。 溶液 I p H 8.0 葡萄糖 50 mM Tris-HCl 50 mM EDTA 10 mM 高温灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。 质粒提取步骤 加入溶液Ⅱ200μl，扣上离心管盖，立即轻轻混匀（来回颠倒数次），至溶液几乎澄清，呈淡黄色透明粘液状。 溶液 II NaOH 0.2M SDS 1.0% 质粒提取步骤 注意事项 时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂； 必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂， DNA断裂成50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了 。 质粒提取步骤 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，扣上离心管盖，轻轻混匀（来回颠倒数次），看到淡黄色消失，有大量白色沉淀生成。冰浴5分钟后，4?C下12000 rpm离心10分钟。 溶液III （pH5.5 3M KAc） 5mol/L乙酸钾 60 ml 冰乙酸 11.5 ml 121?C高压下蒸气灭菌20分钟，储存于4℃冰箱。 质粒提取步骤 溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。 SDS和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。 质粒提取步骤 质粒提取步骤 质粒提取步骤 小心吸取上清液约450μl移入一新1.5ml eppendorf离心管中。注意，不要把白色絮状物混入上清液中。 加入200μl饱和酚和200μl氯仿/异戊醇 （24/1 ），剧烈涡旋振荡，4?C下12,000 rpm离心10分钟。 质粒提取步骤 小心将上清液（约400μl）转移至另一离心管。注意不要将下层有机相混入上清液中。加入2倍体积（800μl）的无水乙醇，剧烈振荡数次，混匀后置于-20?C冰箱中15分钟，然后4?C下12000 rpm离心10分钟。 质粒提取步骤 小心倾弃上清液，注意：避免把离心管底的白色DNA沉淀也随同上清倒掉。将管口敞开倒置于吸水纸巾上使残余液流出，加入500μl 75％乙醇洗沉淀一次，4?C下12,000 rpm离心5分钟。 去上清液，将管口倒置于吸水纸巾上使残液流尽，真空干燥5?10分钟或室温晾干。 加入50μl RNase(40加入40μg/ml)，37℃水浴放置30分钟。 琼脂糖电泳 实验结果与分析讨论 电泳的图谱打印并附在实验报告结果中。 记录质粒电泳的图谱，分析图谱中不同大小条带DNA的构型及其原因。 如果不用RNase A消化质粒溶液，其电泳结果会是怎样的？ * 37℃保温3小时，65 ℃保温5分钟。 SDS Trion X-100 非离子型去垢剂 离子型去垢剂