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免疫细胞分离技术 本实验采用单次密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞。 一、原理 各种血细胞的体积、形态、密度和比重均有差异。 如： 红细胞比重为 1.093 利用一种比重介于1.075-1.092之间等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）混合分离液做密度梯度离心， 离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。 单个核细胞位于分离液面的上层，红细胞和多核白细胞位于分离液的最下层。 血浆 单个核细胞 分离液 粒细胞 红细胞 聚蔗糖(ficoll)分子量为40kD，具有高密度、低渗透压和无毒性的特点。 泛影葡胺(hypaque)用来增加密度，在聚蔗糖溶液中加入适量密度为1.200、浓度为34%的泛影葡胺，即可配制成密度合适的分离液。 分离人外周血淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分离液为最佳。 二、试剂与器材 5．器材: 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等 三、操作方法 　 抗凝全血2ml 缓冲液2ml 三、操作方法 抗凝血 分离液 三、操作方法 血浆 单个核细胞 分离液 粒细胞 红细胞 5．用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取该单个核细胞，移入另一试管，加5ml Hank’s液，混匀。 6. 1500r/min离心10min，弃上清，重复洗涤两次。 7.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液 体积用HanK液还原至1ml。 8.取10ul细胞悬液+90ul白细胞稀释液,混匀，取1滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，计算单个核细胞数。 9. 细胞活力检测 取2滴细胞悬液加1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片，显微镜高倍镜观察。 四、结果判断 活细胞不着色，折光强， 死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。 正常情况下，活细胞数应在95%以上。 五、方法评价 1、密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用方法，具有速度快、纯度高的优点，细胞得率可高于80%，淋巴细胞纯度也可达90%以上，但仅用该方法不能除去其中的单核细胞。 2、分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要，可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用于进一步纯化淋巴细胞。 分离单个核细胞技术 是进行细胞免疫试验的重要技术之一。 思考题 1、免疫细胞的分离还可用哪些方法？试 比较各种方法的特点。 2、试述如何从单个核细胞中除去单核细 胞。 * * 免疫细胞的种类 大部分： 淋巴细胞 单个核细胞 少部分： 单核细胞 Fujian Blood Center / 根据这些差异可将不同的细胞分离。 多形核白细胞比重 1.092 血小板比重约为 1.032 单个核细胞比重为 １.076~1.090 将单个核细胞层取出，经洗涤后即可 用于细胞免疫的某种实验。 常用的聚蔗糖溶液浓度为6%， 密度为1.020 1．标本: 取外周静脉血加肝素钠抗凝， 2ml血约需1000U/L肝素溶液0.01ml。 2．淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺， 比重1.077±0.001）:有商品供应。 3．Hank’s液: 配制方法见附录一。 4．台盼蓝染液: 配置方法见附录一。 1．室温下，将2ml抗凝血与2ml Hank’s液混合 分离液 2．取分离液2ml置入灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释血液3~4ml沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为1：2），两者之间有一明显的界面。 3．用水平离心机以2000r/min离心30min。 4．离心后管内容物分为三层，上层为血浆 （内含血小板），中间层为分离液，底 层为红细胞和多形白细胞，在上、中层 液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核 细胞层。 * * * * *