angtie2信号链在高糖诱导的腹膜血管新生中的作用研究word格式论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 1%结晶紫 (Sigma，美国) D-葡萄糖 (Sigma，美国) 甘露醇 (Sigma，美国) PI 染料液 （BD 公司，美国） Matrigel 凝胶 （BD 公司，美国） 其他常规试剂均为进口或国产分析纯产品 1.5 试剂配制： PBS（1×）：NaCL 8g; KCL 0.2g ;Na2HPO4 1.44g; KH2PO4 0.24g，上述溶质溶于 1L 去离子水中 M199 培养液：取 M199 培养液粉剂 1 包，加入 2.2g NaHCO3 和 2.38g Hepes，溶于 1L 去离子水中，PH 值调整为 7.2. 10%消化中和液：M199 培养液中加入总体积 10%FBS MTT 溶液：称取 250mgMTT，放入烧杯中，加 50mlPBS（0.01mol/L，PH7.4），在电磁 力搅拌机上搅拌 30min，分装，4℃避光保存，两周内有效。 1%结晶紫：称量 1g 结晶紫溶于 PBS（1×）100ml 中 2 方法： 2.1 细胞培养： HUVECs 培养于 ECM 中（含 1000u/ml 青霉素，1000ug/ml 链霉素，5%胎牛血清， 1%内皮细胞生长添加剂 ECGS)，置于 37℃，5%CO2 培养箱中。 图 1 正常环境下体外培养的 HUVECs 形态学 Fig 1 the normal morphology of cultured HUVECs in vitro 左图为镜下（×100）HUVECs 形态，细胞贴壁单层生长，呈铺路石样镶嵌排列；右图为镜下（× 200）HUVECs 形态，细胞扁平多角形，边界清楚，胞浆丰富，胞核呈椭圆形清晰可见。 2.2 实验分组 组别 英文简称 成分 正常对照组 1.5%葡萄糖组 1.5%甘露醇组 C 1.5G 1.5M M199(渗透压 308 mOsm/L) M199+1.5% Glucose (渗透压 396mOsm/L) M199+1.5% Mannitol(渗透压 401mOsm/L) 2.3 四甲基偶氮唑盐微量酶反应（MTT）比色法分析 1）配置 MTT 溶液（5g/L），方法详见上页 2）将 HUVECs 以 1×103 个细胞/孔的密度接种在 96 孔培养板上，贴壁过夜 3) 用无血清 M199 培养液同步 HUVECs 2h 后随机分入各实验组· 4) 各实验组均分别刺激 HUVECs 6h、12h、24h、48h（设置 4 个复孔） 5) 刺激结束后加入 MTT（5g/L）溶液 20μl，37℃培养箱内避光孵育 4 小时 6) 于作用结束时弃去培养液和 MTT，加入 DMSO150μl，避光充分震荡 10 分钟 7) 于酶标仪 490nm 处测吸光值（OD 值） 以上实验重复三次，取平均值 2.4 流式细胞术检测细胞周期 1) 将 HUVECs 均匀接种于 6 孔板内，待细胞生长至 80-90%融合状态时，用无血清 M199 同步 2h 后，随机分入各实验组，分别刺激 6h、12h 2) 用 0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化细胞 3）10%FCS 的 M199 培养液终止消化，离心（1500rpm ×5min） 4）弃上清，PBS 清洗 2 次，离心（1500rpm ×5min） 5）弃上清，加入 70%冰乙醇 3ml，吹打混匀制备单个细胞悬液，4℃过夜固定 6）弃乙醇，PBS 清洗 2 次，加入碘化丙啶 PI 染液 1ml，4℃避光染色 45 分钟 7）流式细胞仪上机检测 以上实验由上海交通大学医学院细胞教研室专人负责上机检测，实验重复三次，取 平均值 2.5 细胞迁移功能检测 1) 将 HUVECs 均匀接种于 6 孔板内，待细胞生长至 80-90%融合状态时，用无血清 M199 同步 2h 后，随机分入各实验组，分别刺激 6h、12h 2) 用 0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化细胞 3）10%FCS 的 M199 培养液终止消化，离心（1500rpm ×5min） 4）弃上清，用无血清 M199 制成 1×106/ml 的细胞悬液 5）将 8 μm Transwell 小室插入 24 孔板内 6）上室加入 200ul 细胞悬液 1×105 细胞/孔 7）下室加入 600ul10% FBS M199 溶液 8）放入 37 °C 细胞培养箱中孵育 12h 9）取出 Transwell 小室，用棉签轻轻拭去上层小室中未迁移的细胞 10）用 4%多聚甲醛固定 20min 11）1%结晶紫浸染 20min 12）PBS 漂洗若干次，待干后，倒置相差显微镜镜下×200 倍观察 13）随机视野下计数拍照 以上实验重复三次，取平均值，采用双盲计数法 2.6 管状结构形成能力检测 1）将