ascs结合可降解pllapcl纳米纤维支架构建功能性尿道的可行性研究word格式论文.docx

ASCs结合可降解PLLA/PCL纳米纤维支架构建功能性尿道的可行性研究博士研究生：彭鄂军指导教师：庄乾元教授曾晓勇副教授中文摘要研究背景与目的平滑肌是尿道的主要功能成分。平滑肌细胞是一种终末分化细胞，一旦受损后很难再生，而且也缺乏合适可替代的肌体组织，因此修复长段尿道的缺损一直是临床上的难题。有些研究者尝试通过脉管系统活检获得平滑肌细胞，然后在体外培养扩增细胞，制备具有机械性能和收缩功能的组织工程肌肉组织。然而这些成熟的平滑肌细胞在体外增殖能力有限，而且多次分化后，容易失去其收缩能力。最为重要的是，体外培养出来的平滑肌排列无规律，因此细胞收缩时，所有细胞不能朝同一方向收缩，难以实现平滑肌细胞群整体的收缩功能。通过组织工程的方法来制备功能性的尿道，需要解决的两个重要的问题就是寻找到理想的种子细胞和合适支架材料，进而培育出具有方向性排列的平滑肌细胞群。干细胞是一类处于未分化状态的细胞，它们具有自我更新能力，而且在一定条件下，能向多种成熟细胞类型分化。尽管胚胎干细胞（ESCs, embryonic stem cells）具有多向分化的潜能，但受伦理、宗教、道德和法律的制约，它们的使用受到限制。自成体组织来源的成体干细胞就不受这些因素的制约，而且因为可以从自体组织取材，能避开免疫排斥反应。脂肪干细胞(ASCs, adipose-derived stem cells)就是一种存在于机体脂肪组织的成体干细胞，它们能够比较容易的从脂肪组织提取，而且体外培养时，显示了很强的增殖能力和向多种细胞类型分化的潜能。例如向脂肪[1-3]、骨[1，2，4]、软骨[1，2，5]、骨骼肌[1，2，6，7]、平滑肌[8，9]组织分化。而且ASCs具有易于大量获得、取材方便的优点，因此可作为用于尿道重建组织工程的“种子细胞”。良好的生物材料支架植入机体后，能够与细胞、机体组织和谐共存。种子细胞与支架材料在体外共培养后，植入体内受损组织部位，能够对机体大块组织缺损进行修补。支架材料分为非可降解材料和可降解材料两类。非可降解材料不能被机体吸收而留在体内，往往不能很好的替代机体组织的功能，如自我更新，新陈代谢及自我优化能力[10]等。可降解材料能对受损组织进行形态、结构及功能上的修复，它们降解为对机体无毒害的CO2和水分子，仅留下支架材料上搭载的细胞与组织融合。本实验所用的PLLA/PCL材料（聚乳酸/聚已内酯）是可降解的聚乳酸(PolyL-lactide,PLLA)和聚已内酯(Poly?-caprolactone,PCL)的共混,通过调整两者的比例可以控制合成材料的柔韧性、伸展性和降解时间，因而制备出组织修复与重建理想的可降解生物支架。本课题应用PLLA、PCL作为原材料，应用静电纺丝技术制备具有方向性的纳米纤维细胞支架，并采用不同细胞外基质来改良材料的粘附性能，体外将自体ASCs在纳米支架上诱导为平滑肌细胞，以期在体外构建出具有整体收缩功能的平滑肌细胞群移植物。实验中研究了不同组份材料与细胞及组织的生物相容性，细胞外基质对材料细胞亲和力以及ASCs向SMCs分化的影响。而且成功将ASCs诱导为平滑肌细胞（AD-SMCs）后，将带AD-SMCs支架接种于兔尿道缺损模型，比较移植前后兔尿道压变化，为探讨ASCs结合方向性PLLA/PCL纳米纤维支架构建功能性尿道的可行性打下了实验基础。材料和方法一．ASCs分离、培养、鉴定和PLLA/PCL纳米纤维支架筛选。1．ASCs的分离及培养采用从新西兰大白兔（雌、雄各半）腹股沟区皮下脂肪、颈背部皮下脂肪、肾脏周围脂肪组织分离出的ASCs作为实验细胞。ASCs分离技术参照Zuk的方法[1]：将兔不同部位取材的新鲜脂肪组织（约1.5g）置入无菌PBS液冲洗后，在含10%FBS 的DMEM 中剪成1-2mm 碎块；无菌PBS 反复洗脱，去除混杂的血细胞和脂肪细胞；置于振荡器内，37℃下0.1%胶原酶消化2小时；等体积含10%胎牛血清的DMEM培养基中止胶原酶反应；250g离心10分钟，取下层细胞团块；含有10%胎牛血清的DMEM培养基分散细胞团块，将细胞浓度调整至1*106/ml后移入无菌培养瓶中；37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。2．ASCs鉴定流式细胞仪检测体外培养ASCs表面的干细胞标记性分子CD106、CD166；细胞免疫组织化学检测CD31、CD45、CD105。3．不同部位ASCs体外增殖能力的比较MTT法检测从腹股沟区皮下脂肪、颈背部皮下脂肪、肾脏周围脂肪组织分离出的ASCs第2 代细胞第1、2、3、4、5、6、7 天的增殖情况，比较三个不同部位来源ASCs增殖能力的差异。4．PLLA/PCL纳米纤维支架的制备利用静电纺丝的方法制备PLLA/PCL纳米纤维支架。参考Ma的方法[11]，基本步骤如下：取1