asic1a对黑质纹状体多巴胺递质释放调节及其分子机制word格式论文.docx

ASIC1a对黑质纹状体多巴胺递质释放的调节及其分子机制中文摘要ASIC1a对黑质纹状体多巴胺递质释放的调节及其分子机制中文摘要第一部分酸敏感离子通道1a在MES 23.5细胞以及斑马鱼体内的表达和功能目的：酸敏感离子通道（Acid sensingion channels，ASICs）是一类胞外酸化激活的非电压门控的阳离子通道。本实验从基因和蛋白水平检测MES23.5细胞和斑马鱼体内ASIC1a的表达，并研究该通道的功能特性，为初步探讨ASIC1a在帕金森病(Parkinson′s disease, PD)发病中的作用提供动物和细胞模型。方法：体外培养MES23.5 细胞，RT-PCR的方法在mRNA水平检测MES23.5 细胞ASIC1a的表达；Westernblotting 方法在蛋白水平检测ASIC1a的表达；细胞免疫荧光标记的方法确定ASIC1a在MES23.5细胞上的分布；全细胞膜片钳检测ASIC1a电流特性；钙离子成像的方法检测MES 23.5 细胞上ASIC1a通道的离子通透性。免疫荧光标记和整体原位杂交方法观察ASIC1a通道在斑马鱼体内的表达分布；全细胞膜片钳检测ASIC1电流特性；行为学实验检测ASIC1对斑马鱼视觉功能的影响。结果：（1）从基因和蛋白水平证实ASIC1a在MES 23.5 细胞上有表达。ASIC1a 主要分布在胞膜和胞浆，与酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）有共表达。（2）MES23.5 细胞胞外酸化可诱发出ASICs 电流，该电流可被阿米洛利（Amiloride）和ASIC1a特异性抑制剂狼蛛毒素（PcTx1）阻断。（3）斑马鱼的脑部和眼球存在ASIC1 基因和蛋白的表达，但是未能观察到与TH的共定位。（4）斑马鱼视网膜视神经节细胞上记录到ASICs电流。（5）阻滞ASIC1 会造成斑马鱼视觉功能障碍。结论：（1）MES 23.5细胞上存在功能性ASIC1a的表达。（2）斑马鱼的视网膜上存在ASIC1的表达，主要分布在视神经节细胞层、内板状层、内核层、外板状层以及感光细胞层。阻滞ASIC1的活性能够降低斑马鱼对光的敏感性，提示ASIC1可能参与斑马鱼视觉功能的调控。本实验为探讨ASIC1a在PD发病中的作用提供了实验基础以及简单易行的模型。中文摘要ASIC1a对黑质纹状体多巴胺递质释放的调节及其分子机制关键词：酸敏感离子通道；MES 23.5 细胞；斑马鱼；视网膜ASIC1a对黑质纹状体多巴胺递质释放的调节及其分子机制中文摘要第二部分酸敏感离子通道1a对胞外酸化诱导的多巴胺递质释放的调控及其分子机制目的：研究ASIC1a对多巴胺递质释放的调节，探讨ASIC1a在PD发病中的作用机制，并观察阻滞ASIC1a能否减轻PD模型中DA神经元的损伤。方法：以MPP+诱导的MES23.5 细胞为研究对象，免疫印迹技术检测MES23.5 细胞ASIC1a、TH、CaMKII的蛋白表达变化。全细胞膜片钳技术检测ASIC1a电流大小及电流特性的变化；高效液相色谱法检测细胞内外DA的水平，计算DA释放率[胞外含量/(胞内+胞外含量) ×100%]。不同浓度PcTx1（0.1nM-10nM）预处理细胞1h，加入MPP+（10uM）作用12h 后，MTT法测定各组细胞的存活率和损伤程度。结果：(1)在MPP+诱导的MES 23.5 细胞模型中，ASIC1a蛋白水平和电流幅度显著增加。（2）以高钾刺激作为阳性对照，胞外酸化可明显增加MES23.5细胞DA递质释放，该作用可被ASIC1a通道阻断剂PcTx1 抑制。（3）在MPP+诱导的MES 23.5 细胞模型中，CaMKII蛋白水平显著增加；无钙外液和CaMKII抑制剂KN-93 减少酸化引起的DA递质释放增加。（4）MPP+处理12小时后，细胞存活率明显下降；PcTx1 预处理1h，细胞存活率显著上升，与MPP+组相比有统计差异。(5)MPP+显著降低MES 23.5 细胞中TH 蛋白的表达；与MPP+组相比，PcTx1（10nM）预处理1h 后，TH蛋白的表达明显升高。结论：组织酸化引起黑质DA神经元上ASIC1a的激活，增加Ca2+的内流，促进DA递质释放；同时Ca2+内流通过激活CaMKI（ICa2+/CaMKII信号通路），上调ASICla通道的功能，进一步促进Ca2+内流，造成胞内DA递质减少，最终导致DA递质耗竭、DA神经元损伤或凋亡。抑制ASIC1a的活性，可减轻其对DA神经元的毒性，从而对细胞发挥一定的神经保护作用。关键词：酸敏感离子通道1a；帕金森病；多巴胺作者：刘沙指导老师：刘春风教授英文摘要ASIC1a对黑质纹状体多巴胺递质释放的调节及其分子机制Regulationandtheunderlyingmechan