bmi1通过抑制ink4aarf靶点促进胰腺癌发生的实验研究word格式论文.docxVIP

摘要目的：探讨运用RNAi技术沉默Bmi-1基因对人胰腺癌细胞恶性行为的影响，为胰腺癌基因治疗提供新的靶点和思路。方法：构建反义Bmi-1真核表达载体转染人胰腺癌PANC-1细胞，运用MTT、荧光显微镜下观察、Western-Blot 等技术检测转染效果；运用流式细胞术检测细胞周期、凋亡变化；RT-PCR检测P16INK4A表达变化；甲基化特异性PCR 检测P16INK4A启动子甲基化变化。结果：（1）成功构建反义Bmi-1真核表达载体并且转染效率较高、效果明显。（2）转染后细胞周期出现阻滞，凋亡明显增加。（3）转染后P16INK4A 表达上升其启动子甲基化程度下降。结论：Bmi-1可作为胰腺癌基因治疗的靶点，Bmi-1可能是通过影响启动子甲基化而实现对P16INK4A表达的调控。关键词:胰腺癌；Bmi-1；P16INK4A；甲基化；流式细胞术AbstractObjective:ToestablishtheeffectknockingdownBmi-1bringtopancreaticcancer cells for gene therapy of pancreatic cancerMethods:ConstructionofantisenseBmi-1vectortransfectedintohumanpancreatic cancerPANC-1.usingMTT,fluorescencemicroscopyobservation,Western-Blot techniquestoassayresults;usingflowcytometrytostudycellcycleandapoptosis; RT-PCRwasusedtostudyP16INK4Aexpression;thepromotermethylationchangesof P16INK4A. was demonstrated by methylation-specific PCRResults:(1)successfullyconstructedantisenseBmi-1vectorandhightransfection efficiency.(2)transfectedcellcyclearrest,apoptosisincreasedsignificantly.(3)the P16INK4Aexpressionoftransfectedcellsincreasedandthepromotermethylationofits declined.Conclusions:Bmi-1couldserveastargetsforgenetherapyofpancreaticcancer,the expressionofP16INK4AmaybeaffectedbyBmi-1viapromotingthepromoter methylation of P16INK4A.Key words:pancreaticcancer;Bmi-1;P16INK4A;methylation;flowcytometry前言肿瘤的发生发展是多种因素下致原癌基因激活和抑癌基因失活的结果，Bmi-1(B-cellspecificmoloneyleukemiavirusinsertionsite1,Bmi-1)属于PcG(Polycomb Group, PcG)蛋白家族，在细胞DNA损伤修复、细胞周期和凋亡调控等方面有着重要的作用。近年来研究发现Bmi-1在肝癌、肺癌、结肠癌、淋巴瘤等多种肿瘤中高表达，提示Bmi-1在研究肿瘤发生发展以及基因治疗等方面可能具有重要作用。目前研究显示，Bmi-1主要通过调控其下游的INK4A-ARF 靶点，该靶点分别编码p16INK4A/Rb、p14ARF/p53而发挥作用。但目前Bmi-1 在胰腺癌中的作用及机制还没有明确。本实验分为三部分，第一部分确定了RNAi沉默Bmi-1基因效率；第二部分研究RNAi沉默Bmi-1基因对人胰腺癌PANC-1细胞生长抑制作用；第三部分探讨RNAi 沉默Bmi-1基因对P16INK4A表达及其启动子甲基化的影响。总之，本实验研究Bmi-1 对胰腺癌PANC-1细胞的恶性生物学行为的影响以及Bmi-1 发挥调控作用的机制，为进一步基因治疗提供新的靶点和思路。实验材料1.1 主要仪器试剂超净工作台（YZ-875,苏州）；酶标仪（TAKARA，日本）；荧光显微镜（OLYMPUS, 日本）；倒置显微镜（OLYMPUS,日本）；流式细胞仪（FACSCAN，美国）；低温高速离心机（德国）；PCR仪（德国）MTT(Sigma)；DMSO(Sigma) ；细胞凋亡检测试剂盒（凯基，中国）；血液/细胞/ 组织基因组DNA提取试剂盒（天