bmp 7与 vegf 联合诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究word格式论文.docxVIP

三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明 确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名： 日期： 三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究 工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部 或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊 发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位， 并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名： 日期： 内 容 摘 要目的：实验的目的在于建立体外分离、扩增培养人骨髓间充质干细胞（BMSCs） 的方法，及描述其生物学的特征。了解骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)和血管内皮细胞生 长因子（VEGF）联合诱导人骨髓间充质干细胞 (BMSCs)向软骨细胞分化，通过深入认 识两种细胞因子相互之间的作用，可给软骨组织工程的种子细胞来源提供一种新的途 径。方法：1）实验采用密度梯度离心法与贴壁分离法相结合分离人 BMSCs，将分离 得到的 BMSCs 进行 0.4% 台盼蓝染色，并计算细胞的活性。将得到的细胞用含 15%胎 牛血清的 DMEM-LG 普通培养，待细胞 80％以上融合后用 0.25%胰蛋白酶溶液进行消化 传 代 ， 将 传 代 至 第 四 代 细 胞 。 取 传 代 至 第 四 代 细 胞 行 流 式 细 胞 表 面 抗 原 CD34/CD44/CD45/CD29/CD90 鉴定。2）实验共分四组，对照组 A 组不加任何生长因子，实 验 B 组加入 800ng/ml VEGF，C 组加入 200ng/ml BMP-7，D 组加入 200ng/ml BMP-7 + 800ng/ml VEGF 进行向软骨诱导培养，诱导第 21 天后终止培养，各组间行细胞增殖 比较，苏木素伊红（HE）染色观察各组细胞形态学改变、各组行 RT-PCR 检测软骨细 胞Ⅱ型胶原 mRNA 表达水平、Western blot 测定软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达水平，比 较各组间差异。结果：1)苏木素伊红（HE）染色示：A 组：软骨细胞稀疏、着色均匀、边界清晰， 以椭圆形、多角形为主，胞浆呈紫红色，胞核呈蓝色以圆形、椭圆形为主；其余 B、 C、D 组，软骨细胞数量增多 ，着色均匀、边界清晰，以椭圆形、多角形为主，胞浆 呈紫红色，胞核呈蓝色以圆形、椭圆形为主。2)在 A、B、C、D 四组诱导培养 21 天后， RT-PCR 法检测细胞Ⅱ型胶原 mRNA 的表达水平分别为 0.2851±0.0102 、0.3343± 0.1210、0.5122±0.0937、0.7162±0.1032，各组间差异均有统计学意义(P0.01)；Western blot 测定Ⅱ型胶原蛋白表达水平分别为 0.3292±0.0067、0.4717±0.0062、 0.6175±0.0055、0.7803±0.0052，各组间差异均有统计学意义(P0.01)。结论：通过密度梯度离心并结合贴壁培养的方法，能够分离出较纯的 BMSCs，后 经过培养及扩增后能获取一定数量的 BMSCs，基本上能满足组织工程的需要。采用细 胞因子 BMP-7 和 VEGF 的联合应用比较单个细胞因子可以明显促进骨髓间充质干细胞 增殖，并能促进诱导其向软骨细胞表型分化。关键词：骨髓间充质干细胞 骨形态发生蛋白-7 血管内皮细胞生长因子 软骨 分化AbstractObjective : To detect a method to in vitro delaminating and amplificative cultivating marrow mesenchymal stem cells(MSCs), and describe the biocharacteristics. To explore the function of bone morphogenetic protein-7 and vascular endothelial growth factor in inducing human BMSCs to the cartilage cell, make clear the synergistic reaction between the two cytokines, to provide a new