实用高效液相色谱法建立纠错版-第8章-梯度洗脱.doc

第8章 梯度洗脱 8-1引言 如前所述，等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变（例如50%甲醇-水），而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的（例如5→100%甲醇-水）。梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。图8-1所示为几种不同类型的梯度变化，其中线性梯度最为常用。除另有说明，本书中均假设为线性梯度。图8-1所示为流动相组成在20 min内，B浓度由0增大为100%（线性梯度，5%/min）。 许多样品用梯度洗脱会分离更好，但许多实验室却对梯度洗脱的应用存在很大偏见。其原因有如下几点： 1、有些实验室尚不具备梯度洗脱设备。 2、梯度洗脱更复杂，似乎更难进行新方法建立与常规分析。 3、某些HPLC检测器（如示差折光检测器）不能使用梯度洗脱。 4、每次运行梯度洗脱后需重新平衡色谱柱，耗时较长。 5、不同设备的分离结果可能不同，所以梯度洗脱法移植时会出现差异。 6、梯度洗脱中的基线问题更为普遍，并且必须使用高纯溶剂。 7、某些色谱柱╱流动相的联合应用不适于梯度洗脱。 如权衡采用梯度洗脱对每一分离的优缺点，那么很多分离将只适于使用梯度洗脱。本章中我们将说明梯度洗脱分离实际上与等度洗脱非常相似，因此梯度洗脱的方法建立和日常操作与等度洗脱相比并不太难。在8-5节中我们将探讨上述列举的梯度洗脱中存在的问题，以及如何避免或减少这些问题的方法。 图8-1不同的梯度形状 下面的讨论主要针对反相条件，但是其它HPLC模式的梯度洗脱也遵循相同的原理。我们以目前对梯度洗脱详尽而全面的理解，可以通过几次初始实验的分离情况对以后分离进行准确地预测（见10-2-2节）。 8-2梯度洗脱的应用 1、具有较宽k值范围的样品（即等度条件下不可能使所有谱峰达到0.5k20）。 2、大分子样品（如分子量大于1000，尤其是生物样品，见第11章）。 3、样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。 4、溶于弱溶剂的样品稀溶液（如用反相柱分离的样品水溶液）。 此外，即使最终有可能使用等度方法，初始实验采用梯度洗脱往往是HPLC方法建立的最佳起点。 8-2-1梯度洗脱用于常规分析 8-2-1-1样品的保留值范围 选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。图8-2所示为二烷基邻苯二甲酸酯混合物的分离，该同系混合物包括二甲基（1）、甲乙基（2）、二乙基（3）、二正戊基（9）邻苯二甲酸酯，在C8柱上采用不同组成的乙腈-水流动相进行分离。50%B的等度分离可以获得较好分离度[见图8-2a关键峰对1╱2的Rs=1.5，但运行时间较长（70 min）]；而且，后面谱峰（8和9）展宽，难以检测。采用较强流动相（65或80%B；图8-2b和c）可使运行时间缩短，峰8和9变窄，有利于检测和定量。然而，前面谱峰1~4的分离效果变得很差（关键峰对的Rs0.8）。由于前面谱峰需用较弱流动相（如50%B），而后面谱峰需用较强流动相（如80%B），所以该样品采用等度条件分离不够理想。 图8-2 二烷基邻苯二甲酸酯同系物的反相HPLC分离 样品峰为C2（二甲基，1号峰）至C10（二正戊基，9号峰）；25×0.46cm 5μm C8柱 ，乙腈（B）-水流动相；2.0ml/min；60 0C。 该样品采用梯度洗脱则分离很好（见图8-2d）：10 min梯度，20→100%B。所有峰均很好地分离（关键峰对1╱2的Rs=1.5），运行时间仅11min，所有谱峰都很窄，利于检测及准确定量。对于保留值范围较宽的样品，梯度洗脱显然是良好的选择。采用梯度洗脱的另一个原因是：在等度洗脱条件下，k 20的晚流出峰往往会出现较严重拖尾，如图8-3a中羧酸混合物的离子交换分离。而采用梯度洗脱的同一样品（图8-3b），色谱图中最末峰仍较窄，峰形也很好，前面谱峰的分离得以改善。然而应注意，梯度洗脱并不能解决所有谱峰的拖尾问题。 图8-3 离子交换色谱分离芳香羧酸混合物 （a）55mM硝酸钠水溶液流动相的等度分离；（b）10→100mM硝酸钠水溶液流动相的梯度洗脱。 8-2-1-2大分子样品组分 大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）一般采用梯度洗脱分离会更好，尤其用反相分离条件时。这类样品的等度保留往往对于流动相组成（%B）的微小改变极其敏感，难以将保留值控制在合适的范围内。例如丙醇-水流动相等度RPC分离碳酸酐酶（一种分子量29000Da的蛋白质）时，仅改变±0.1%B，则会导致保留时间±20%的变化。当用梯度洗脱代替等度条件时，HPLC分离大分子时也会使峰形有较大改善。 8-2-1-3晚流出组分 有些样品采用等度洗脱可很好地分离（有关谱峰达到0.5k20），但所含有的晚流出干扰组分会污染色谱柱或对后续分离产生干扰。图8-4a所示为对单一化合