单克隆抗体技术讲解.pptx

第四章 抗体工程制药 第三节单克隆抗体的制备掌握：单克隆抗体的概念和特点、制备原理， 制备方法及基本过程熟悉：单克隆抗体技术的应用了解：单克隆抗体的发展1.单克隆抗体的发展 2.单克隆抗体的概念和特点3.单克隆抗体技术的应用4.单克隆抗体的制备过程主要内容没有单克隆抗体前人类所遇见的问题银屑病手口足病亚急性湿疹癌症用于诊断鉴定人的血型类别犬瘟热病毒单克隆抗体 用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤用于寻常型银屑病亚急性湿疹单克隆抗体药物一、单克隆抗体技术发展Georges J.F. KohlerCesar Milstein1975年将产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合, 成功建立了单克隆抗体技术。1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。二、单克隆抗体的概念及特点1.概念（1）抗体：是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。（2）单克隆抗体（monoclonal antibody ）：(简称单抗 )，由经过特定的抗原处理过的效应B细胞和骨髓瘤细胞杂交得到的杂交瘤细胞产生的具有特异性识别某抗原上的某一个特定抗原决定簇的抗体。 2. 单克隆抗体的特点优点 ：（1）理化性状高度均一、结构、氨基酸顺序、特异性等 一致（2）生物活性单一、灵敏度高（3）与抗原结合的特异性强，适用于以标记抗体为特点 的免疫学分析方法（4）便于人为处理和质量控制，来源容易，可以在体外 “永久”地存活并传代 （5）可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗局限性 ：（1）固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围（2）反应强度不如多克隆抗体（3）制备技术复杂、费时费工、价格较高三、单克隆抗体技术的应用1.检验医学诊断（1）病原微生物抗原抗体的检测：乙肝表面抗原试纸（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定：早孕检测试纸、女性排卵检测试纸（5）细胞因子的测定（6）其他：吗啡类毒品检测试纸等2.蛋白质的提纯3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术四、单克隆抗体制备过程致敏淋巴细胞的准备骨髓瘤细胞的准备细胞融合选择性培养抗体分泌细胞的筛选克隆化过程 单克隆抗体的制取1.致敏淋巴细胞的准备动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式—体内、体外 剂量—0.5-100?g 次数—视抗原而定 间隔—视抗原而定 佐剂—视抗原而定收集时间：末次接种后72 h2.骨髓瘤细胞的准备细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT缺陷状态HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶3. 细胞融合骨髓瘤细胞致敏淋巴细胞培养液 10 mL50%PEG 1 mL离心 1000rpm 10 min37 °C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min离心 1000rpm 7min加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内4. HAT选择性培养 HAT是用于筛选具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶 (TK)活性缺陷细胞的培养基。含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。HPRT和TK缺陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培养基。5. 抗体分泌细胞的筛选对筛选方法的要求： 多——大量样品一次检测； 快——迅速取得检测结果； 准——检测结果可靠性高； 灵——检测方法灵敏度高。常用筛选方法： ELISA、IFA等有限稀释法6. 克隆化过程方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞计数105/ml104/ml103/ml5-20/孔7. 单克隆抗体的制取体外—培养罐法注射特定抗原蛋白体内—腹腔接种培养骨髓瘤细胞B淋巴细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞专一抗体检验阳性克隆上述杂交细胞 分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞注射到小鼠体内体外培养单克隆抗体思考：1、如何大量生产单克隆抗体？2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？ 谢谢 祝：同学们学习进步