第二章 发酵过程生物学基础.ppt

96 96 （ 3）菌体循环利用 这种方法大致过程是：待分批发酵终了将菌 体与发酵液分离，收集的菌体经去杂菌等处 理后返回发酵罐，再加入无菌培养基进行第 二批发酵，因发酵液中菌体浓度很高，故发 酵时间可大大缩短。第二批发酵终了，进行 同样处理，然后再开始第三批发酵；这种技 术与前面所述两种技术原理不同，但也能起 到缩短发酵时间、提高设备利用率的作用。 高浓度微生物的培养 97 97 （ 4）高细胞浓度培养中的问题 ? 培养基流加控制与其他条件控制 ? 菌体分离装置的效能 ? 菌种退化 高浓度微生物的培养 98 98 四、代谢工程 Metabolic engineering ? Targeted improvement of cellular activities by manipulation of enzymatic, transport, and regulatory functions of the cell with the use of rDNA technology. Jay Bailey 1991. Toward a science of metabolic engineering. Science 252:. 1668–1675 基本思想是： 根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤 ，进行遗传操作 99 99 代谢工程：定向改造微生物的自然能力 以生产(降解)某种物质为目标的工业生物技术，需要 ? 拓展底物利用能力和范围 ? 引入新的合成途径，或延伸已有途径 ? 减少副产物形成；提高产量、产率和生产强度 ? 改善细胞生理功能 传统育种：随机突变，非理性设计 代谢工程：定向遗传修饰，理性设计 × × × 原料 代谢工程策略 丙酮 碳水化合物 丁醇 C3 酮 C6 糖~P 利用系统生物学手段，发现新 C6 糖~P C6 糖~P C3 醛~P C3 羟酮~P C3 酮酸 C3 酮酸~P C4 酸 C3 二醇 C4 醇 C2 ~P C2 酸 C2 醛 C2 醇 C5 酮酸 C4 CoA 100 100 C4 CoA C2 CoA × × C6 酸 × C3 酸~P 的支路途径和调控位点 设计新的代谢工程策略 × × × × C3 烯酸 代谢工程策略 碳水化合物 原料 C3 酮 C6 糖~P C6 糖~P C6 糖~P C3 醛~P C3 羟酮~P C4 醇 C2 ~P C2 酸 C2 醛 C2 醇 C5 酮酸 C4 CoA 101 101 C3 羟酸 × C3 酸~P C3 烯酰CoA C4 CoA C3 酮酸 C2 CoA × × C3 酮酸~P C6 酸 C4 酸 C3 二醇 丙烯酸 实现代谢 途径重构 丙酮 丁醇 遗传修饰 出发菌株 设计策略 高效生产菌株 代谢分析 代谢工程的基本思路 ? 设计策略是基础 ? 遗传修饰是关键 102 102 103 103 代谢工程设计 ? 改变代谢流 ? 扩展代谢途径 ? 构建新的代谢途径 104 104 1，改变代谢途径 ? 改变代谢途径是指改变分支代谢途径的 流向，阻断其他代谢产物的合成，以达 到提高目标产物的目的。 ? 改变代谢途径有各种方法，如加速限速 反应、改变分支代谢途径流向、构建代 谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法 。 105 105 （1）加速限速反应 ? 最成功的一个例子是头孢霉素C的代谢工程菌的构 建。 ? 青霉素N是头孢霉素合成的中间体。当用顶头孢霉 发酵时，发现了青霉素N的积累，这表明下一步酶 反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤。因此克隆 了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF，并 导入顶头孢中，所得转化子的头孢霉素C产量提高 了25％，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。 头孢霉素C的代谢工程菌的构建 α-氨基己二酸 中间产物 克隆了编码 脱乙酰氧基 头孢霉素C 合成酶基因 cefEF 青霉素N 限速步骤 头孢霉素C 所得转化子头孢霉素C产量提高了25％，而青霉素N 的积累量减少至原来的1/16。 106 106 64 64 一、提高初级代谢产物产量的方法 1，使用诱导物