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犬发炎性肠疾(Canine Inflammatory Bowel Disease) 摘要： 本文主要以1997年至2007年期间，对全国各地发生不明原因的犬发炎性肠疾(Canine Inflammatory Bowel Disease) 案例进行分子病毒学与微生物学研究，发现大部分犬发炎性肠疾的抗原病毒能与细菌生长过程中所产生的分泌物产生协同作用，使原本不致病的犬病毒表现为致病致死的强病毒。 关键词： 犬发炎性肠疾(Canine Inflammatory Bowel Disease) 病毒协同作用 抗生素多抗性细菌 前言 犬发炎性肠疾（CIBD）是病因不明的肠内慢性炎症性疾病，在20世纪70年代末期才被兽医发现，但发病原因至今仍无法确定。过去兽医较为接受的两种病因理论有： 细菌的感染，由于抗生素可以治愈这些CIBD病例，所以细菌被认为是致病原因，但是至今尚无人能分离出病原菌且将其移至健康实验犬的肠道而使其致病，所以无法证明此理论的真实性； 肠道内抗原抗体反应。支持这理论的学者认为犬食用了具抗原性的食物，在肠道内引发抗原抗体反应而致发炎，细胞通透性增大，有些大分子蛋白质便进入肠粘膜中而引发抗原抗体反应，使炎症反应恶化而成为恶性循环。由于德国狼犬、沙皮、洛威及纯种犬较易获得此病，发病年龄由4月龄至15岁龄。因此，有些学者认为此病与遗传有关。 CIBD的症状为：呕吐、下痢、先急后重、粪便带血或有粘液、体重下降、胀气、食欲下降等。病犬表现一种或多种症状，多半有下痢，但下痢并非必定出现的症状。 病犬的病情与犬本身的免疫力以及受损肠道的面积有关，个体差异较大。大肠发炎则使肠道蠕动幅度变小。小肠发炎则有呕吐、体重下降、食欲改变及大量下痢的症状。 渐进性CIBD的症状为：患犬最初可能只是一个月呕吐或下痢1次；一段时间后则增加到1周1次或1日1次，严重者甚至1日数次呕吐及下痢。病程由数星期到数月不等。 由于病因不明，CIBD只能靠排除其他病因来诊断。当病犬出现呕吐、气胀、下痢、便血或粪便带有上皮细胞膜、食欲减少或不食体重下降等病症。兽医一般会检查是否因饮食不当、食物敏感、寄生虫、肠道阻塞、胰酶或其他消化酶不足、细菌或病毒感染、肠道淋巴瘤等等原因所引起；一一排除了这些致病的原因后，如果病犬的病情仍无改善，则推断为CIBD。 实验目的与方法 犬发炎性肠疾（CIBD）的发病原因至今仍无法确定。尽管在实验室的检验中分离得到很多病原体（包括病毒及细菌），但在动物回归实验中不能引起实验动物致病。但实际上在200多个CIBD病例中都引起了犬发病及死亡某些细菌生长过程中所产生的分泌物产生协同作用，使原本不致病的病毒为致病致死的强病毒微生物与细胞体外同体培养装置生长过程中所产生的分泌物产生协同作用1.1 实验材料 病毒株收集自各多个场动物、医院等。扩增各类病毒基因片段的PCR引物扩增病毒基因片段的PCR引物由及保存。分子生物学试剂、细菌药敏检测试剂超静台及其他分子病毒学、微生物学的实验用具为本实验室常规用品。细菌尘埃收集器为自制产品。微生物与细胞体外同体培养装置为本的专利发明。ELISA，菌种鉴定及菌种的抗生素抗性检测参照文献(6~17)的方法进行。并将80个CIBD样品经PCR检测结果为犬病毒阳性的原始病料用电子显微镜作病毒的形态鉴定，挑选出来15个代表病毒株，继续以下实验。 1.2.1.1 鉴定并发细菌感染对病毒感染致病性影响 将病毒阳性的原始病料里的细菌作菌体单克隆，再将有代表性单克隆细菌与病毒共同接种于以下条件的细胞培养物中，细胞培养方法参照文献(15)进行：述细菌接种于一与细胞隔离但通过孔径不大于0.22微米微孔的滤膜与细胞培养物相通的培养室中，具体步骤： 分别将细菌接种于固体LB培养皿中，37℃培养12小时，挑取单菌落并作菌种鉴定。 分别在4个克氏细胞培养瓶中用常规的细胞培养液1640培养WCK细胞系待WCK 达80% 融合时，接种待鉴定的20个病毒样品； A组： 将单克隆细菌分别接种于1个特制微型细菌培养室再分别将1个细菌培养室放入已长有细胞的1个细胞培养瓶的培养液中37℃培养12小时后取出细菌培养室继续培养36小时。 B组： 分别接种1个CIBD病毒样品入细胞培养瓶，于37℃培养48小时。 C组： 将分别接种了单克隆细菌的1个细菌培养室移入细胞培养瓶于37℃培养12小时后取出细菌培养室继续培养36小时。 D组： 瓶不接种任何病原的细胞培养物作为对照组，继续培养。观察各组细胞培养瓶有无CPE出现。 细菌药敏试验参照文献(18)的方法进行1.3 判断 根据在已接种低致病性病毒的细胞培养物出现CPE的情况，可得到以下的鉴定结果： 如果只有接种类枯草杆菌的细胞培养瓶出