可溶性蛋白质测定.pptVIP

综合性实验:  盐胁迫对植物生理活动的影响 * * 《植物生理生化实验》 45学时 授课教师 《植物生理生化实验》是分析植物体的物质组成、植物的生命活动规律及其与外界环境关系的一门科学，是实验性很强的学科，也是培养大家实验能力和综合素质的重要环节。 面向专业：农学、园艺、茶学、植保、农资等专业的必修专业基础课。 《基础生物化学实验》 21学时《植物生理学实验》24学时 课程简介 周 序 2008-2008学年第一学期 《植物生理生化实验－生化部分》实验教学进程表　 实 验 内 容 计划学时 第6周 第7周 实验一 植物组织可溶性蛋白质的测定 实验三 植物组织游离氨基酸总量测定 第8周 实验四 淀粉酶活性的测定 第10周 实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物过 氧化物同工酶 第11周 实验六 硝酸还原酶活性的测定(活体法) 第12周 实验二 维生素C含量的测定(2，6—D法) 4 3 3 3 5 3 样品用量 植物材料 实验项目 对照 处理 0.5g 0.5g 实验一 植物组织可溶性蛋白质的测定 1g 1g 备 用 1g 1g 实验五 PAGE电泳分离过氧化物同工酶 1g 1g 实验四 淀粉酶活性的测定 1g 1g 萌发的水稻种子 清水对照 高盐处理 低盐处理 实验三 植物组织游离氨基酸总量测定 打 包 实验三　植物可溶性蛋白质含量的测定 1、了解测定植物体内可溶性蛋白质的意义和用途； 2、了解可溶性蛋白质测定的几种方法，并比较其优缺点； 3、掌握斐林-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其要点； 4、掌握标准曲线的绘制方法； 5、熟练722S型分光光度计 、离心机的使用方法 植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标；在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。 为什么要测定可溶性蛋白质？ 可溶性蛋白质常用的测定方法有哪些？ 考马斯亮蓝G-250法 紫外分光光度法 Folin-酚法 (这些方法灵敏度不同对物质的反应也不一样) 考马斯亮法： 是一种染料结合法, 反应灵敏, 1分钟内即可完成显色, 操作简便快速灵敏度比Folin酚高出4倍,但不足的是在蛋白质含量高时线性关系较差,重复性差。同时染料很容易吸附在比色杯上，操作中稍不注意,误差很多。 紫外分光光度法： 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。 优点：紫外吸收法简便、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 不足点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲 线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和 色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。 故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。 Folin酚法： 灵敏度比双缩脲高100倍, 操作简单, 重复性好, 但也有不足点:试剂配制比较难,样品中若含有大量酚基、柠檬酸和巯基化合物均有干扰。所以，如含酚类物质较高的试验材料就不宜用Folin酚法测定。 该法适于微量蛋白的测定（范围为5～100μg蛋白质） 福林（Folin）－酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应： 第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质－铜络合物； 第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。 A=kcb 一、Folin酚法原理 试剂配制： 植物材料： 萌发的水稻种子 Folin酚试剂甲液：20%碳酸钠 1mol/L 氢氧化钠 1%硫酸铜 2%酒石酸钾钠 Folin酚试剂乙液：磷钼酸、磷钨酸 标准蛋白液 清水对照 高盐处理 低盐处理 使用仪器： 操作步骤： 1．样品提取 称取鲜样0.5克于研钵中， 加入2ml蒸馏水、石英砂，充分研成匀浆， 再加入适量蒸馏水，研磨均匀