ebsdmog法对人ipsc向血管内皮细胞的分化作用研究word格式论文.docx

参考文献 ………………………………………………………… 27英文摘要 ………………………………………………………… 30 致谢 ………………………………………………………… 32 缩略词表 ……………………………………………………………33 论文原创性声明 …………………………………………………34 附：综述 …………………………………………………………35EBs-DMOG 方法对人 iPSc 向血管内皮细胞的分化作用研究专业 ：内科学（心血管病），研究生：刘慧 ，导师：杨天和教授，蒋清安教授摘要 目的：能够用于细胞治疗的血管内皮细胞来源有限。为获得足够的内皮细胞，本研究探讨一种新的促进人诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSc)向血管内皮细胞分化的方法，即拟胚体（embryoid bodies，EBs）-甲基乙二 酰氨基乙酸（Dimethyloxaloylglycine，DMOG）法，获得足够的血管内皮细胞为 血管内皮细胞移植治疗心血管疾病奠定基础。方法：应用未分化的人 iPSc，先将其形成 EBs，然后用如下 6 种方法进一步 诱 导 促 进 其 向 血 管 内 皮 细 胞 分 化 ： A. 常氧； B. 常氧 + 血 管 内 皮 生 长 因 子（ Vascularendothelialgrowthfactor ， VEGF ）（ 20mg/ml ）； C. 常氧 +DMOG（0.3mmol/L）；D.缺氧；E.缺氧+VEGF；F.缺氧+DMOG。观察 iPS-EBs 分化的 血管内皮细胞形态结构，并且用逆转录 PCR（ RT-PCR）法及免疫荧光细胞法检 测内皮细胞特异基因（CD31, CD34, VE-cad, KDR, vWF）的表达，以判断血管内 皮细胞分化情况。结果：1.使用孕 12 天的昆明小鼠制备原代成纤维（Mouse fibroblasts，MEF） 细胞，传代培养到第 3 代后细胞经丝裂霉素 C 去分化处理可以获得最佳状态饲 养层细胞。2.状态较好的人 iPSc 在饲养层细胞上培养第 7 天可见克隆生长，第 12 天可形成供实验使用的细胞。3.机械法划取 iPSc 克隆，在低粘附培养板用 EBs 培养基悬浮培养制备状态较好 EBs，经胶原蛋白铺板后贴壁培养 13 天可以诱导 生成少量血管内皮细胞。4.iPS-EBs 在常氧条件下，添加脯氨酸羟化酶抑制剂（DMOG)显著促进内皮细胞特异基因 CD31, CD34, VE-cad, KDR, vWF 的表达。 在常氧条件下，添加 DMOG 进行诱导分化，是相对合适的诱导分化条件。能成 功表达内皮细胞特异基因 CD31, CD34, VE-cad, KDR, vWF。在细胞水平，CD31, CD34 为膜表达，KDR、vWF 为胞浆表达。其分化形成的内皮细胞数量和质量明 显高于其他组(P＜0.05)。结论：本研究成功建立了促进人 iPSc 向血管内皮细胞分化的 EBs- DMOG方法，此方法可更好地促进人 iPSc 向血管内皮细胞的分化，比目前常用的其它分化方法所获得的血管内皮细胞数量多。此方法的建立为下一步用人 iPSc 分化的血管内皮细胞治疗心血管疾病奠定了基础。【关键词】DMOG；人 iPSc；诱导分化；血管内皮细胞；前 言心血管疾病又称循环系统疾病，可以细分为急性和慢性两种，一般与动脉硬 化有关，是危害人类健康的重大疾病，在发展中国家，因动脉硬化(atherosclerosis， AS)引发的心脑血管疾病是最常见死因[1,2]。血管内皮细胞(Vascular endothelial cells ，VEC )的损伤学说是多数学者倾向的AS的发病机制, 血管内皮细胞结构和 功能的完整性是预防AS和维持血管稳态的关键[3,4] 。血管内皮细胞移植是治疗该 类疾病的重要方法。然而，由于血管内皮细胞来源有限，制约了此项治疗措施开 展。近来发明的iPSc细胞技术，为血管内皮细胞的获得提供了新的来源。但是， 目前的iPSc分化方法，所获得的血管内皮细胞量少。如何才能促进iPSc向血管内 皮细胞分化，从而向获得大量优质的血管内皮细胞，是应用iPSc治疗心血管疾病 过程中亟待解决的关键问题。目前将iPSc分化成血管內皮细胞的方法有两大类，一类是直接用在iPSc培养基中加 入 诱导分 化 的因子 如 血管内 皮 生长因 子 （ vascular endothelial growth factor，VEGF）[5,6]等，将其分化成为血管內皮细胞。另一类方法为，先将iPSc 形成EBs进行初步分化，然后再加相应的诱导因子进行进一步分化。然而，这些 方法所获得的血管內皮细胞较少，难以满足临床需要。寻找更为有效的促进iPS