红树林来源streptomyces sp.ouc6819中drimentines类化合物生物合成研究word格式论文.docxVIP

目录第一章前言11.1 链霉菌简介11.2 天然产物及其应用21.3非核糖体肽类(NRPs)化合物31.3.1 通过改变单体的识别改造NRPs51.3.2 通过改变单体数改造NRPs61.3.3 通过修饰酶结构修饰NRPs71.4 异戊二烯化生物碱类化合物81.5 二酮哌嗪(Diketopiperazines,DKPs)101.6 本课题研究目的和意义12第二章Streptomycessp.OUC6819基因组文库的构建142.1引言142.2 实验材料152.2.1 菌株与质粒152.2.2 主要实验仪器152.2.3 实验试剂162.2.4 培养基与缓冲液配方162.3 实验方法192.3.1 菌种保藏192.3.2 大肠杆菌质粒的快速提取202.3.3 碱裂解法质粒提取步骤202.3.4 质粒去RNA处理202.3.5链霉菌总DNA提取212.3.6 载体的去磷酸化21Streptomycessp.OUC6819基因组DNA的纯化21Streptomycessp.OUC6819基因组DNA的部分酶切222.3.9 载体SuperCos1的处理及与目的片段的连接232.3.10 噬菌体体外包装242.3.11 侵染宿主菌242.3.12 基因组文库质量检测及保存252.4 结果与分析252.4.1载体与基因组DNA的处理252.4.2 文库质量及随机性检测262.5 本章小结26第三章Drimentines生物合成基因簇的克隆与分析273.1引言273.2 实验材料273.2.1 实验菌株与质粒273.2.2引物283.3 实验方法283.3.1E.coli电转化感受态细胞的制备及转化283.3.2 链霉菌与大肠杆菌间的接合转移293.3.3发酵304.1引言404.2 实验材料404.2.1 实验菌株及质粒404.2.3引物414.3 实验方法414.4 结果与分析414.4.1 Cos4 在天蓝色链霉菌中的表达414.4.2pHC2在天蓝色链霉菌中的表达434.4.3pHC5在天蓝色链霉菌中的表达454.5 本章小结47第五章DriM的体外表达与产物酶学性质研究485.1引言485.2 实验材料485.2.1 菌株及质粒485.2.2缓冲液485.2.3引物495.3方法505.3.1 目的基因的扩增及载体的处理505.3.2 酶的表达515.3.3 酶的纯化515.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳525.3.5 蛋白浓度测定535.3.6 酶催化活性的检测535.4 结果与分析54pET28a::driM重组质粒构建54DriM的表达55DriM的催化活性565.5讨论60第六章总结与展望616.1 本研究工作总结616.2 主要创新点616.3Drimentines生物合成研究工作展望62参考文献63致谢 68第一章前言1.1链霉菌简介链霉菌(Streptomyces)是一类生长在土壤、沼泽或海洋环境中，具有复杂形态分化的好氧革兰氏阳性菌，是放线菌中最大的菌属。已经有报道的链霉菌有超过500种，其基因组DNA的G-C含量为69~78%。链霉菌能够产生丰富的次级代谢产物，陆生放线菌一直是临床药物和工业上应用酶的重要来源，目前已有报导的微生物来源的生物活性物质，有60%以上是由放线菌产生的[1]，来源于链霉菌的抗生素占所有抗生素的52%，包括抗生素如链霉素、新霉素、四环素和氯霉素等，因此，链霉菌是药物合成的天然宝库。链霉菌基因组中存在众多的负责次级代谢物生物合成的基因簇，对第一个天蓝色链霉菌A3(2)的全基因组序列分析表明，可能有20个以上的基因簇负责次级代谢，大量基因参与调控、转运、环境适应及各种次级代谢活动，这对认识链霉菌的多样性、环境适应性及链霉菌产生各种生物活性物质具有重要意义[2]。由于越来越多的病原菌具有抗药性以及对陆生放线菌产生的抗生素的研究受到阻碍，研究方向开始转移到海洋。海洋面积广、环境特殊，生物量约是地球总生物量的80%，蕴含丰富的微生物物种，大约每立方米的海水中具有106的细菌和103真菌存在，深海沉积物中微生物种类更加多样（约每毫升湿土中含有109细菌)[3]，因而可能作为新抗生素的重要来源。深海沉积物中含有超过1300种不同的放线菌分类单元，通过16srRNA序列分析推测大部分代表新的种属[4]。由于海洋环境的特殊性，赋予了生存在海洋环境中的生存的链霉菌的遗传及生态功能多样性，能够耐高盐、高压、低渗、缺氧等特殊生存条件，这为海洋链霉菌次级代谢产物多样性提供了物质基础，因此，可能会产生有别于陆生链霉菌的新的代谢产物。2000年，Moore等首先报道了海洋微生物次级代谢产物肠道菌素(enterocin)的生物合成基因簇[