基于蛋白质反式剪接在大肠杆菌中重组鲎c因子sushi多肽-recombinant tachypleus amebocyte lysate c factor sushi polypeptide in escherichia coli base on protein trans-splicing.docx

基于蛋白质反式剪接在大肠杆菌中重组鲎C因子Sushi多肽英文摘要Sushi1genesequencesweresuccessfullyconstructedforastablyandhighlyexpressed bacterial strain.Afterbeingculturedinalargerflask,thesebacteriawerefracturedand thenpurifiedusingaffinitychromatography.Thetwoprecursorproteinsunderwentin vitroproteintrans-splicingreactiontoproducttherecombinantSushiprotein,whose endotoxinbindingactivitywasfinallydetected usingdynamicfluorescenceassay.Keywords:Intein;Trans-splicing;Tachypleus tridentatusFactorC;SushiPeptide; EndotoxinWritenby:YingyingWangSupervisedby:LinglingGuoIII目录前言11本课题的研究背景12内毒素及其检测32.1 内毒素及其毒性反应32.2内毒素检测33 鲎C因子作为内毒素检测试剂的开发43.1 鲎试剂43.2 鲎C因子54蛋白质反式剪接及其在蛋白质工程领域的应用74.1蛋白质内含子74.2 蛋白质内含子的顺式剪接（Cis-splicing）机制74.3蛋白质内含子的反式剪接（Trans-splicing）机制94.4蛋白质反式剪接的应用105本课题的意义及研究主要内容10实验材料与方法131 实验材料与仪器131.1实验材料131.2实验仪器142 实验技术与方法152.1.主要试剂的配制152.2主要实验方法16结果与讨论221Sushi基因片段的筛选和基因构建221.1CES12，SspDnaX序列的获得及断开位点的选择221.2pTA2/CES12载体的构建23pTA2/his-DnaX-CES12质粒的构建25pTWIN/his-DnaX-CES12-N/C质粒的构建272His-DnaX-CES12-N/C融合蛋白的表达和纯化和复性282.1His-DnaX-CES12-N/C融合蛋白的表达282.2His-DnaX-CES12-N/C融合蛋白的纯化302.3His-DnaX-CES12-N/C蛋白去除内毒素312.4His-DnaX-CES12-N包涵体的复性313体外蛋白反式剪接反应324动态荧光浊度法检测剪接产物内毒素结合活性32结论35参考文献38附录44攻读学位期间公开发表的论文45致谢46前言1本课题的研究背景细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外层上特有的结构，其化学成分为脂多糖（LPS）[1]。内毒素主要来自于细菌死亡后释放出来的物质，故而又被称为“热原”，是革兰阴性细菌的主要致病物质，因而备受临床医师和相关研究人员的重视[2]。目前的临床器械大多未经严格的热原去除，与血液直接接触的注射器等医疗工具很有可能会向患者体内直接或间接地引入内毒素，进而引发内毒素的毒性反应。脂质A在不同的革兰氏阴性细菌壁上结构基本相似，因此大多数由革兰氏阴性菌引起的感染具备大致相同的内毒素毒性反应，临床表现为发热反应，微循环衰竭，低血压，白细胞反应，酸中毒，缺氧，内毒素休克等[3-5]。研究发现，细菌内毒素并不能像外毒素一样被稀甲醛作用生成类毒素。而且，由于不是蛋白质，内毒素具有极强的耐热性而稳定性，常规的高温方法破坏其生物活性，一般的生产条件很难达到要求，而将医疗器械用强酸碱或强氧化剂处理也不可取。这对制药和医疗器械行业无疑是一个巨大的挑战。临床上也有必要应用可靠灵敏的内毒素检测试剂及早预测，避免大量内毒素积聚，给患者带来不良影响。1956年美国约翰霍普金斯大学动物学家F.Bang首次发现，美洲鲎在注射了革兰氏阴性细菌内毒素后可会发生血液凝固。1964年Lerin等在美洲鲎体内及体外证实了微量内毒素即可使鲎细胞溶解物产生凝胶状物质。20世纪70年代美国有专家提取变形细胞溶解物（LAL）制成鲎试剂，创建了检测微量内毒素的检测技术并获得美国FDA批准上市。我国药品检验应用鲎试验始于天津市药检所，1988 年卫生部颁布了细菌内毒素检查法，使我国药品检验应用步入官方承认阶段。中国药典收录的细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度法，使用鲎试剂来定性或定量检测内毒素。鲎试剂（LAL/TAL）是国际上至今为止检测内毒素最好的方法[6]，具有简单、快速、灵敏、准确等特点，可以检测出fg（10-15g）级水平的内毒素[7]，已