基于细胞芯片的表面等离子体共振成像技术及其在药物研究中的应用-surface plasmon resonance imaging technology based on cell chip and its application in drug research.docx

中文摘要 重庆大学博士学位论文 I  PAGE 2 摘 要 在化工制药研究中，利用表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR） 技术评价候选药物与其作用靶点的结合性能，进而对其进行筛选是药物开发的重 要步骤。作为一种光学传感方法，表面等离子体共振技术具有实时、免标记、高 灵敏度等优点，但是传统的 SPR 应用需要先从细胞内提取、纯化目标分子，然后 将其固定修饰在传感芯片表面，操作复杂，耗时费力；此外，离开了细胞环境， 目标分子的化学构象及生物活性都可能发生改变，影响实验结果的准确性。因此， 本文利用基于细胞芯片的表面等离子体共振成像技术（Surface Plasmon Resonance image，SPRi）原位测量细胞表面的生物化学反应。 首先，本文利用基于细胞芯片的 SPRi 技术研究了免疫荧光试验中荧光标记分 子对细胞表面生物分子结合反应的影响，说明了免标记技术在生物化学研究中的 重要性。该章研究使用带正电、负电及电中性的有机荧光分子标记麦芽凝集素 （Wheat Germ Agglutinin，WGA），然后分别测量免标记的 WGA 以及三种被标记 WGA 与细胞表面糖蛋白受体分子之间的结合吸附-解离脱附过程，并通过改变溶 液离子浓度进一步验证荧光分子电荷的影响。结果表明：荧光标记分子的电荷性 质显著影响细胞表面配体-受体（Wheat Germ Agglutinin - Glycoprotein）分子之间 的结合吸附过程以配体分子在细胞表面结合位点的分布区域。这种影响主要来源 于细胞膜本身所带负电荷，可以促进被正电荷荧光分子标记的配体分子与细胞表 面受体分子快速结合；而细胞膜表面电荷分布不均一，也造成不同荧光分子标记 的配体分子在细胞表面结合的分布区域存在差异。 然后，本文通过稳定光源温度和锁定传感芯片位置，改善了实验装置信噪比， 实现了原位监测单克隆抗体药物分子（Herceptin）与细胞表面受体分子（Her2） 之间的动态结合过程，藉此分别测量了 Herceptin 分子与不同细胞系细胞以及肿瘤 组织原代细胞表面 Her2 分子之间的键合反应。结果表明：不同细胞系细胞表面， 甚至同一细胞系不同细胞表面 Herceptin-Her2 相互作用的结合动力学常数有明显 差异，这种差异在肿瘤组织的原代细???表面表现的更加显著。从而强调了免标记 单细胞研究的结果更加准确可靠。 其次，针对在临床治疗过程中，肿瘤细胞会对单克隆抗体药物分子 Herceptin 产生耐药性的问题，本文测定了在药物敏感和药物耐受细胞表面，Herceptin-Her2 分子间反应的结合动力学曲线，并通过双通道荧光染色技术进一步解释药物分子 在药物耐受细胞表面结合动力学改变的原因。实验发现：由于粘蛋白 Muc4 的过度  表达阻碍了部分 Herceptin-Her 分子反应的结合位点，在药物耐受细胞表面一些 Herceptin 分子脱附解离速度显著增大，无法有效作用于肿瘤细胞，导致药物分子 Herceptin 的后期治疗失败。 最后，本文利用基于细胞芯片的 SPRi 技术研究了新型靶向纳米药物在细胞表 面的结合性能。本章实验通过 Protein A 分子的共轭螯合作用，制备了表面修饰不 同 密 度 靶 向 识 别 分 子 Herceptin 的 金 纳 米 颗 粒 （ AuNP ） 作 为 靶 向 纳 米 药 物 （Herceptin@AuNP），再分别测定了上述纳米药物在 Her2 表达浓度不同的细胞表 面的动态结合过程。实验发现：靶向纳米药物（Herceptin@AuNP）表面的识别分 子（Herceptin）密度以及细胞表面目标受体分子（Her2）的表达浓度都会显著影 响靶向纳米颗粒在细胞表面的结合方式。纳米颗粒（AuNP）会影响识别分子 （Herceptin）与受体分子（Her2）之间的结合性能，靶向纳米药物只有与受体分 子（Her2）之间发生双（多）键合反应才能有效结合在细胞表面。 上述结论完善了基于细胞芯片的 SPRi 技术，拓宽了该技术的应用范围，强调 了免标记单细胞分析在生物检测及药物分析中的必要性和可靠性；同时也揭示了 电荷对细胞表面生物化学反应的影响、阐明了肿瘤细胞对单克隆抗体药物产生耐 药性的动力学机制、发现了影响靶向纳米颗粒在细胞表面结合性能的主要因素。 这些都有助于人类进一步理解生化反应的本质、加快新型药物开发进度、提高疾 病诊疗效率。 关键词：表面等离子体共振，细胞成像，分子相互作用，单克隆抗体，靶向纳米 药物 英文摘要 重庆大学博士学位论文 III  PAGE 4 ABSTRACT Surface plasmon resonance (SPR) is being wi