吉富罗非鱼精原干细胞分离与体外培养的分析-isolation and in vitro culture of tilapia spermatogonial stem cells.docxVIP

吉富罗非鱼精原干细胞分离与体外培养的研究摘要精子的发生是一个复杂而精细的过程，精原干细胞（spermatogonial stem cells， SSCs）在雄性性腺中受神经内分泌和环境因子的协同作用而有条不紊的进行自我更 新和分化，以维持机体正常的生精功能。精子作为向子代传递遗传信息的载体是进行 遗传物质改良的最好材料，而生殖干细胞又是形成精子的前提细胞，可利用基因工程 技术生产饲料转化率高、抗病力强及具有优质蛋白质的转基因动物。尽管人们对精子 发生的一般过程和调节机制有所了解，但对多数动物精子发生的特点和调节机制仍然 认识不清楚。因此在体外模拟雄性动物性腺微环境培养 SSCs 对揭秘精子的发生过程 和调节机制具有重要意义，为体外生产精子并以精子为载体生产转基因细胞、组织和 动物提供材料和技术，不仅可保护濒临灭绝的遗传资料也可以生产具有商业价值的新 品种或转基因动物。哺乳动物 SSCs 体外分离、克隆及诱导等的研究取得了较大的进 展，而鱼类 SSCs 的研究仅限于斑马鱼和青鳉鱼等少数鱼类，国内罗非鱼 SSCs 体外 分离培养的相关研究鲜有报道，关于罗非鱼 SSCs 分离、克隆及冻存的方法还需进一 步优化和探讨，因此本研究以雄性吉富罗非鱼为模型动物，取精巢为试验材料做如下 研究：1.采用不同消化液和不同分离方法获得 SSCs 和 SCs，探讨 CO2 和 Hepes 浓度 对罗非鱼精巢细胞原代培养时的影响，然后从形态学及 HE、油红 O 及 AKP 染色等 方法对 SSCs 和 SCs 做初步的鉴定；2.用差速贴壁法、克隆环法和机械法对 SSCs 和 SCs 进行纯化，用不同饲养层培养罗非鱼 SSCs 并选择出有利于 SSCs 增殖的饲养层， 然后探讨分别添加吉富罗非鱼精巢提取液、斑马鱼胚胎提取液、EGF 或 bFGF 时，对 以 SCs 为饲养层培养的 SSCs 增殖的影响，并绘制生长曲线，以建立吉富罗非鱼 SSCs 的扩增体系；3.用不同的冻存液和降温方式冻存吉富罗非鱼 SSCs 和 SCs，然后用相 同的方法解冻并检测 SSCs 和 SCs 的解冻存活率，最后选择出有利于 SSCs 和 SCs 冷 冻保存的冻存液和降温方式。试验结果表明：1．用胰蛋白酶消化吉富罗非鱼精巢组织后所得的总细胞数和活细胞数都显著高 于 0.1%胶原酶Ⅳ和 0.04% EDTA·Na2（P0.05），而首次贴壁时间比 0.1%胶原酶Ⅳ 和 0.04% EDTA·Na2 组明显缩短（P0.05）；胰蛋白酶组与组合酶（胶原酶和胰蛋白 酶，下同）组相比总细胞数、活细胞数和首次贴壁时间都无显著差异（P0.05），但 胰蛋白酶组消化时间比三个组都短，因此用胰蛋白酶可高效、快速的分离到吉富罗非 鱼精巢细胞，用 L-15+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L 谷氨酰胺+1mmol/L 非必需氨 基酸+1%罗非鱼血清+10% FBS 培养分离的细胞，由于组织块培养后得到的杂细胞较多，进一步纯化 SSCs 和 SCs 较困难因而不宜采用；添加 5% CO2 浓度时不利于吉富罗非鱼 SSCs 和 SCs 的生长，SSCs 和 SCs 培养的前 3d 宜在 pH 为 7.2-7.4 的培养液中 生长，随着培养时间的延长，较高的 pH 更有助于 SSCs 和 SCs 的增殖。经鉴定胰蛋白酶分离所得的细胞主要为 SSCs 和 SCs，显微镜观察和 HE 染色发 现 SSCs 依附在 SCs 上呈圆形或卵圆形，体积较大，胞质透明并以集落形式生长，油 红 O 染色发现 SSCs 胞质中几乎没有脂滴，AKP 染色呈阳性，而 SCs 呈三角形或多 边形，胞质中含有丰富的脂滴，AKP 阴性不着色。2．采用机械法纯化后 SSCs 和 SCs 的纯度分别为 85%和 88%；当有 60%-70%SCs 贴壁时可对其进行传代，一般 3-4d 传一代，SCs 共传了 5 代；当饲养层上有大量 SSCs 集落时对 SSCs 进行传代，发现原代培养至第 5-6d 时是 SSCs 传代培养的最佳时期。 由于 SSCs 增殖缓慢，一般 7d 传一代，已传至第 5 代，隔 3d 换一半的培养液，传代 过程中 SSCs 和 SCs 均保持原来的形态。SCs 饲养层与小鼠胎儿成纤维细胞和大鼠胰 腺上皮样细胞饲养层相比显著促进 SSCs 增殖（P0.05），而后两种饲养层几乎对 SSCs 的增殖没有影响，反而随着培养时间的延长抑制其生长。以 L-15+1%罗非鱼血清+10% FBS 为基础培养液，SCs 为饲养层，分别添加不同 浓度的罗非鱼精巢提取液、斑马鱼胚胎提取液、EGF 或 bFGF 扩增吉富罗非鱼 SSCs， 采用 CCK-8 法测定第 1-7d 的细胞的光密度，绘制细胞生长曲线。结果显