枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶发酵培养基的研究.docVIP

枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究 通过单因素实验在摇瓶条件下对枯草芽胞杆菌产碱性蛋白酶的液体培养基进行优化，确定了最佳碳源为糊精。进一步在5L的发酵罐上进行发酵并对发酵过程进行控制得到以下结论：枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶为生长相关型发酵类型，生长周期为38h，发酵到36h时酶活达到最大?，酶活最大值为433U/mL，此时pH为8.35，OD600为1.158。可以用pH是否超过8来当作发酵终点的表观特征。 材料与设备 1.菌株?：枯草芽孢杆菌 2.材料与试剂? 福林试剂、三氯乙酸（0.4mol/?L）、碳酸钠溶液（0.4mol/L）、干酪素溶液(10g/L)氢氧化钠溶液（0.5mol/L）、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、无水氯化钙。 ?3.?仪器与设备? 恒温水浴锅、分光光度计、5升发酵罐、离心机、试管、吸管、滤纸、酸度计、高压灭菌锅、超净工作台?、恒温摇床?? 4.?培养基? 基本培养基：胰蛋白胨5g/L、柠檬酸钠3?g/L、磷酸氢二钾10?g/L、氯化钙3?g/L? 种子培养基：胰蛋白胨5g/L、酵母粉5?g/L、葡萄糖10?g/L、磷酸氢二钾18?g/L? 发酵培养基：酵母粉2g/L、胰蛋白胨3?g/L、糊精50?g/L、柠檬酸钠3g/L、、磷酸氢二钾10?g/L、氯化钙3?g/L? 配培养基时水用自来水。 方法 酶活测定? 标准曲线制备? 表1不同酪氨酸浓度下的吸光值A680? 管号 酪氨酸 浓度（ug/L） 酪氨 酸使用/ml 水/ml 0.4mol/L Na2CO3 吸光 值/A680 0? 1 2 3 4 5 0 10 20 30 40 50 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 5 5 5 5 5 5 根据表1，以酪氨酸浓度为纵坐标，吸光值A680横坐标，绘制标准曲线。由绘制出的曲线进行线性回归得线性方程。令x=1算出y值，即得到吸光常数K的值 ?酶活测定公式?计算酶活公式如下：? 样品的酶活力(U/ml)＝（A680*n*k*4）/10? 式中：A?为样品平行实验的平均吸光度；K?为吸光常数取96.54；4?为反应试剂的总体积(ml)；10?为反应时间(min?)；n?为稀释倍数。? 酶活力单位定义为：在温度55℃?pH10.0?条件下，1min?水解酪素产生1μg?酪氨酸所需酶量定义为1?个酶活力单位，以U?表示。? 摇瓶条件确定最佳碳源 3.1配制碳源分别为不同唯一碳源的培养基，在150mL的三角瓶中装25mL并在121℃下高压灭菌20min。? 3.2以接种量为4%进行无菌接种? 3.3在摇床中37℃下培养48h，转速为160r/min,pH为自然。? 3.4把样品稀释成10倍和50倍，在12000r/min离心15min，取上清液测定酶活。? 3.5以酶活为指示确定最佳碳源? 4发酵罐过程控制? 160?r/min，37℃恒温振荡培养12?h制备种子液，采用5?L发酵罐，接种量为2.5%。发酵罐中的装液量为60%，进行恒溶氧变温发酵。并在发酵开始12h时开始过程控制，每隔2?h?取样，并记录温度、转速、溶氧，发酵液在2?000?r/min，离心15?min，取上清测定发酵液的OD600、pH值、A680并采用福林法测定蛋白酶活力 结果与分析 1碱性蛋白酶活力测定的标准曲线制备? 2不同碳源对芽孢杆菌产碱性蛋白酶的影响? 分别选用蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉制备不同碳源为唯一碳源，在基本培养基及其他条件不变的情况下，以酶活为指示确定最佳碳源为糊精。 四．结果?