07 氨基酸分析检测.pptVIP

目 录 Chapter1 纸层析法 Chapter2 高效液相法 Chapter1 纸层析法 操作步骤与方法 发酵液预处理 用可调微量移液器吸取1.0mL发酵液于1.5mL小离心管中，高速离心（10000r/min，2min）沉淀菌体等固形物。 测定方法 ⑴ 层析纸的准备：裁取30cm长、20-22cm宽的新华3号滤纸，注意使滤纸的纤维方向与短边一致。在距滤纸长边边线2cm处用铅笔画一直线，每隔2cm设一点样点（共14个），写上点样标记。 ⑵ 点样：用微量进样器将氨基酸标准液或已处理好的待测样品2微升点在层析滤纸的相应点样点上，自然晾干或用电吹风吹干，点样斑点直径控制在4mm内。 ⑶ 展开：将点好样的滤纸置于装有约5mm深展开剂的层析缸内，平衡1h后放下滤纸，当展开剂前沿上行至距离滤纸顶端2cm时取出滤纸，置于通风橱内风干。 ⑷ 显色：用喉头喷雾器将层析纸上均匀喷上显色剂，于90-100℃恒温干燥箱内显色10-15min。 ⑸ 斑点显色后，把L-缬氨酸显色斑点滤纸剪成细条状，放入比色管中，加入洗脱液5mL摇动洗脱40min，用752型分光光度计（数字显示）于560nm波长下测定吸光度。以不同含量的L-缬氨酸标准液显色斑点对应的吸光度为纵坐标，L-缬氨酸含量为横坐标绘制标准曲线。由标准曲线的直线回归方程推导出发酵液中L-缬氨酸含量计算公式。每次测定时，剪下与样品斑点面积相当的无显色斑点的滤纸作空白对照。 纸层析操作 　　 实验结果与讨论　　 注意事项 1．切勿用手直接接触滤纸和显色剂。 2．点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3．使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。 Chapter2 高效液相法 液相色谱的特点 分离效率高 应用范围宽 分析速度快 样品用量少 灵敏度高 分离和测定一次完成，自动化程度高 适用于高沸点及具有生物活性的物质的分离定， 可用于制备 缺点： 设备及实验费用高 对某些体系分离效率不高 高效液相色谱仪的组成 1、输液系统 储液瓶、脱气方法、高压输液系统（高压泵） 低压梯度洗脱和高压梯度洗脱 2、进样系统 3、色谱柱系统 4、柱温箱 5、检测系统 6、馏分收集器 7、控制系统 进样系统 通常使用耐高压的六通阀进样装置 常压下进样 检测系统 （1）紫外－可见检测器 （2）光电二极管阵列检测器 （3）荧光检测器 （4）示差折光检测器 实验步骤 实验条件 色谱柱：ODS 柱(15cm×4.6mm，5μm) 流动相：MeOH-H2O（80∶20） 柱温：室温 检测器：UV 254nm 流速：0.8ml/min 氨基酸测定方法详述 氨基酸专用系统配置 主要试剂及配置方法 衍生试剂溶液：0.5％ 2,4－二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液 衍生缓冲溶液的配制：称取衍生缓冲溶液固体组分（NaHCO3）4.2g加入至100mL容量瓶中，定容并摇匀后备用。 定容缓冲溶液的配制：称取定容缓冲溶液固体组分（磷酸二氢钾）3.4g，加入至500mL容量瓶中，加入0.1mol/LNaOH145.5mL定容。 流动相A的配制：乙腈－水（1：1）：相同体积的乙腈与水混合，超声波脱气10-15min。 流动相B的配制：流动相B固体成分（NaAc）8.2g加水约1800mL，用醋酸调pH至6.4，加20mLN,N-二甲基甲酰氨，加水至2000mL，超声波脱气10-15min。 氨基酸标样：秤取1.00g色谱纯氨基酸，用水溶解后，定容至25mL，配成40g/L的氨基酸标准溶液。 发酵液预处理：用可调微量移液器吸取1.0mL发酵液于1.5mL小离心管中，高速离心（10000r/min，2min）沉淀菌体等固形物。 衍生方法 方法：准确量取发酵液原液10微升，加入装有0.2mL衍生缓冲溶液的5mL塑料离心管中，然后加入0.1mL衍生试剂溶液，摇匀，将塑料离心管置于60℃水浴中暗处恒温加热60min后取出，注意不要让水进入离心管，放置待溶液冷至室温后，加入定容缓冲液1mL并摇匀，放置15min后可以开始进行色谱分离。 谱分离条件 色谱柱为依利特公司氨基酸分析专用ODS柱；检测系统为：LabAliance HPLC,柱温：33℃；采用二元梯度分析，梯度程序如表所示；全波长检测；流动相总流量为1mL/min。 流动相梯度时间表 计算方法 定性和定量方法 (1)根据保留时间和紫外吸收谱进行定性分析。 (2)外标峰面积法进行定量测定。 (3)计算 a.标准曲线的绘制 以不同浓度的L-亮氨酸标准液测得的峰面积为纵坐标，L-亮氨酸含量为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程： Y=kX 式中Y：峰面积 X：L-亮氨酸标准品浓度 b.发酵液中L-亮氨酸含量计算