枯草芽孢杆菌讲解课件.pptx

枯草芽孢杆菌 Bacillus Subtilis;Contents; 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌，芽孢杆菌属的一种。因为易在枯草浸液中繁殖，所以人们取名枯草芽孢杆菌。革兰氏阳性菌，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。 ;枯草芽孢杆菌能够分化成具有不同形态和功能的细胞。最特征的形式是在营养不足的情况下产生的内生孢子。在我们的项目中，我们利用了内生孢子的生产。因为它们是极其稳定的，孢子是用于功能性融合蛋白的。;枯草芽孢杆菌的自然栖息地是土壤，被迫适应许多环境变化。因此，枯草芽孢杆菌的特征在于快速和狡猾的反射和复杂的生活方式。由于其天然的能力，它可以占据外源DNA并将其整合到其基因组中。灵活应对环境，转向营养或避免有毒物质，它的活动是借助其鞭毛。如果饥饿，一些细胞甚至成为食人兄弟姐妹。如果条件对于生存来说太糟糕了， 枯草芽孢杆菌可以形成内生孢子。这些是非常休眠和高度稳定的阶段，耐干燥，紫外线，热和压力。一旦这些孢子遇到更好的条件，他们才能再次发芽。;01; 迄今为止大部分的合成生物学操作都是基于大肠杆菌（Escherichia coli）的，大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌具有革兰氏阴性菌不具有的一些优势，比如：革兰氏阳性菌有天然的外源基因摄入和整合入基因组的机制，这种机制为遗传操作提供了方便；革兰氏阳性菌的分泌机制比较完善，蛋白质表达后可以很好地分泌到细胞外，而这正是革兰氏阴性菌在异源蛋白表达时面临的最大问题。 ;枯草芽孢杆菌可以复制大肠杆菌的质粒，但是有一种更优雅的方式引入外源DNA片段。当侧面与枯草芽孢杆菌基因组同源时，将通过在该基因座处的同源重组以高效率整合，随后用染色体复制。这导致稳定的单拷贝基因组改变，从而避免使用复制质粒发生的拷贝数伪影。这种不同的基因操作的方式需要使用整合载体，如通过我们提供B4-22。因此，枯草芽孢杆菌是合成生物学的理想遗传平台。;为了使枯草芽孢杆菌满足合成生物学模式生物的要求，核心就是构建模块化的标准。这倒也???是很困难，只需要将大肠杆菌的基因零件标准在枯草芽孢杆菌的质粒上重构一下就可以了，枯草芽孢杆菌质粒与大肠杆菌不同之处是存在基因组整合位点，将这个位点引入还有零件标准的质粒中，就构建成了枯草芽孢杆菌标准化质粒了。之后，慕尼黑大学构建了一系列适用于芽孢杆菌的启动子，包括常规表达的启动子和诱导表达的启动子。另外，他们还测试了常用的报告基因在这个质粒系统中的表达情况，这些报告基因都针对枯草芽孢杆菌进行了密码子优化（Coden Optimization）。这些报告基因包括绿色荧光蛋白、lacZ、荧光素酶。最后，他们测试了常用的蛋白纯化标签在枯草芽孢杆菌中的作用。这些工作并没有什么出彩之处，因为他们的正常工作早已经被验证过。有了标准化质粒、启动子、终止子、报告基因和纯化标签，一个合成生物学模式生物就基本上建立了。 ; 引入枯草芽孢杆菌作为基于BioBrick的合成生物学的新底盘是此项目的主要目标。 B4-22核心部分包含以下芽孢杆菌的特定部分 Vertors（载体） promoters（启动子） reporters（通讯员） affinity tags（亲和标签） 我们所有的标签都是由GeneArt合成的。我们的亲和标签还未验证。;它们都通过在特定位点的双重同源重组插入到基因组中。因此，枯草芽孢杆菌中的靶基因被破坏，可以通过特定的检测来选择。 ;01;一，安德森系列启动子评估它们已经在大肠杆菌中被广泛测量，在枯草芽孢杆菌中测定了11只安德森启动子，并显示相对较弱的活性。 二，组成型芽孢杆菌启动子 构建了三种新的枯草芽孢杆菌启动子（P liaG，P veg，P lepA）PliaG该启动子显示比Anderson启动子高得多的活性，但与其他评估的芽孢杆菌启动子相比仍然相对较弱。Pveg这个推动者是我们评估中最强的。PlepA该启动子的活性在最强的芽孢杆菌启动子P veg的活性和弱P liaG之间。 P XYL - xylR是从木糖诱导启动子枯草芽孢杆菌。对于这种启动子，我们尚未成功克隆到报告载体中以评价活性。;三，诱导性芽胞杆菌启动子 启动子的最后一组包括来自两个诱导型启动子的枯草芽孢杆菌，P LIAI和xylR -P XYL。一种新的抗生素诱导的启动子P lial其响应于干扰细胞壁的完整性和生物合成的抗生素。在刺激的情况下，双组分系统LiaRS被激活。活化的响应调节剂LiaR与启动子的操纵子结合并诱导ia基因座的转录。当启动子启动时，表达了两种蛋白质LiaI和LiaH。该启动子的主要优点是在不存在诱导物及其高动态范围的情况下具有非常低的基础活性。用不同浓度的