白蛋白融合α-2b干扰素在毕赤酵母中的表达.docVIP

白蛋白融合α-2b干扰素在毕赤酵母中的表达 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):45～49 张伍魁1范清林2邹文艺2仲皙3 宋礼华1，2* （1 安徽医科大学基础医学院合肥2300322 安徽安科生物工程股份有限公司合肥230088) (3 中国药科大学南京210009） 摘要α2b干扰素的重组表达质粒pPIC9KHSAIFNα2b经限制性内切酶SalI酶切线性化后电转化巴斯德毕赤酵母菌（P.Pastoris）SMD1168，将阳性转化子进行PCR鉴定和Mut表型鉴定并用甲醇诱导表达，WesternBlot结果表明白蛋白融合IFNα蛋白与IFNα抗体具有结合能力，Wish细胞VSV病毒系统鉴定表达蛋白具有抗病毒生物活性。在摇瓶培养条件下，甲醇在0.5%~4.0%的范围，随着浓度的升高蛋白表达量也升高，在其他因素固定时,菌体起始OD值在5~80的范围内,随着OD值的升高表达量反而下降。成功表达出具有高生物学活性的白蛋白融合干扰素蛋白（HSAIFNα2b），为进一步应用打下基础。 关键词白蛋白融合α2b干扰素巴斯德毕赤酵母菌Wish细胞VSV病毒系统 收稿日期：20051115修回日期：20051205 *通讯作者，电子信箱：Songlh@干扰素（interferon, IFN）是机体免疫应答过程中产生的一类非特异性可溶性小分子糖蛋白,分子量20000~30000，于1957年由Issacs和Lindeman首先发现［1］，主要由网状内皮细胞和淋巴细胞产生，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生特异的蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因的转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤的活性。虽然不同类型的干扰素从80年代逐渐进入临床研究与应用，但其临床应用仍有一定限制，因为干扰素在血液中的半衰期很短，平均为1.5~2.8h，静脉注射后很快从血中消失，故很难在血清中维持较高的浓度，临床应用需多次反复给药，容易诱发干扰素抗体的产生、患者耐受性差等问题。因此开发出在体内具有较长半衰期较小副反应的长效干扰素成为目前干扰素研究的热点。目前延长干扰素在人体内半衰期的方法主要有聚乙二醇（PEG）修饰法、微球法等，虽然都成功地延长了干扰素在体内的生物半衰期，但分别存在异原反应及生物利用率低等问题。人血清白蛋白（HSA）是人体循环系统内的可溶性蛋白，在调节胶体渗透压、营养和促进伤口愈合等方面起着巨大作用，而且还可作为载体物质参与药物在体内的运输功能，其生物半衰期 t1/2为14~20d。本研究旨在通过将白蛋白与干扰素融合基因在巴斯德毕赤酵母（P.Pastoris）中融合表达以得到具有较长生物半衰期、较小副反应的长效干扰素。 1材料与方法1．1材料 1．1．1质粒、菌株、细胞和病毒含白蛋白干扰素融合基因（HSAIFNα2b）的分泌型表达质粒pPIC9KHSAIFNα2b由本室自行构建。大肠杆菌DH5α，蛋白酶缺陷型P.Pastoris SMD1168,GS115/Albumn(mutS)Gs115/βgal（mut+）均购自Invitrogen公司，水泡性口炎病毒（VSV）和Wish细胞均为本室保存。 1．1．2工具酶、培养基与主要试剂限制内切酶，Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司，蛋白胨、酵母提取物等培养基主要成分均购自上海生工公司，配置方法参见Invitrogen公司的Multicopy Pichia Expression Kit，抗IFNα 2b单克隆抗体（一抗）由本室自制［2］，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（二抗）购自Santa Cruz公司。 1．2方法 1．2．1酵母表达载体的电转化取单菌落P.Pastoris SMD1168接种于5ml YPD液体培养基，28~30℃ 培养过夜，取1ml接种于100mlYPD培养基中继续培养至OD600在1.1~1.3之间，停止培养，2500r/min离心10min，收集菌体，菌体用去离子水和4℃ 1mol/L的山梨糖醇（DSorbitol）各离心洗涤2次，最后用1ml预冷的1mol/L山梨糖醇重悬菌体；取制备的感受态细菌100μl与事先用Sal I单酶切线性化的重组表达质粒pPIC9KHSAIFNα2b（5~10μg）混匀转入0.2cm电转杯，冰浴5min，用Easyject Optima电转仪在450V，150vF和335R条件下进行电转化。转化后菌体立即加入0.8ml预冷山梨糖醇，混匀后将菌液涂布于MD选择平板（1.34% YNB,4x10-5% biotin，2.0% dextrose, 1.5%agar），于28~30℃，培养3~5d，观察转化结果。 20