分光光度技术的定性和定量.pptVIP

分光光度技术  有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物 质由于其分子结构不同，对不同波长线的吸收能力 也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。 分光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是(分光光度法)主要是指利用物质特有的 Lambert和Beer定律。 基本原理 朗伯—比尔定律 朗伯—比尔定律数学表达式 　　 A=lg(1/T)=Kbc A为吸光度,T为透射比,是透射光强度比上入射光强度 ，c为吸光物质的浓度， b为吸收层厚度 物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比. 朗伯-比耳定律成立的前提 　　(1) 入射光为平行单色光且垂直照射. 　　(2) 吸光物质为均匀非散射体系. 　　(3) 吸光质点之间无相互作用. 　　(4) 辐射与物质之间的作用仅限于光吸 收,无荧光和光化学现 A=lg(1/T)=Kbc 1.物质不同，则吸光系数不同，所以吸光系数可作为物质的特性常数。 2. 溶剂 3. 波长（吸收峰对应的波长为最大吸收波长，在此处测定的灵敏度最高） 4.单色光的纯度 . 分光光度计的主要部件 分光光度计的主要部件 光源 要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯（钨比灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。 分光光度计的主要部件 分光系统（单色器） 单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。 分光光度计的主要部件 吸收池 吸收池也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。 分光光度计的主要部件 检测器系统 指示仪表 分光光度法的定性方法 举例 用紫外光谱鉴定化合物 是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。 评价 紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。 分光光度法的定量方法 吸光系数法 标准曲线法 对照法 吸光系数法 根据A=-logT=εbc 当特定波长的单色光通过溶液时，样品的吸光度与溶液中吸收物浓度和光通过的距离成正比。 Ε和b已知，可从文献查到，在测得A的情况下，可求出被测物的浓度。 标准曲线法 A=KC 先配置一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件相同的条件下，分别测定其吸光度，然后以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图，在相同的条件下测出样品的吸光度，就可以从标准曲线上查出样品溶液的浓度，如果要求精确测定，可回归直线方程计算样品溶液的浓度。 评价 操作简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。 但是每次样品分析的色谱条件很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。 对照法 在同样条件下配置 标准溶液和样品溶液，在选定波长处，分别测量吸光度，根据定律A标=EC标l；A样=EC样l，在同种物质、同台仪器和同一波长测定的条件下E 和l均为定值。所以A标/ A样= C标/ C样可得 C样= （C标8* A样） / A标 在生化实验中主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子的鉴定和酶催化反应 紫外-可见分光光度法的特点 1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快。 2 灵敏度高 * 分光光度技术的定性和定量方法 *