抗体制备与纯化.pptVIP

单克隆抗体的特点 ①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；② 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应 2、骨髓瘤细胞 ①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml； ③细胞株处于良好的生长状态，细胞株保持HGPRT缺陷状态。 目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①SP2／0—Ag14（简称SP2）； ② P2—X7 -—Ag8·6·5·3（简称653） 3、饲养细胞 在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。 常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞 ，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片， * 第一节 常规抗血清的制备方法 一、动物的免疫 二、抗血清的采集 1、免疫动物的选择 2、抗原接种 3、佐剂的应用 动物的免疫 免疫动物的选择 种属与品系 经济性 “R”型与“H”型 经验性适配 抗原接种 剂量： 注射途径： 间隔与免疫时间： 接种次数： 佐剂的概念与种类 概念：与抗原同时或先于抗原进入 机体，以提高抗原的免疫原 性的物质。 种类：非免疫原性物质 免疫原性物质 佐剂的作用机理 延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈 促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化” 1、采集方法 2、血清的分离与灭活 抗血清的采集 采集方法 一次性采集 多次性采集 抗血清的分离与灭活 血清析出的温度 血清的灭活 第二节 单克隆抗体的制备方法 一、单克隆抗体与杂交瘤技术 二、单克隆抗体的制备过程 三、单克隆抗体的特性 单克隆抗体与杂交瘤技术 1、单克隆抗体 2、杂交瘤技术 表位A 表位B 表位C 抗原 克隆A 克隆B 克隆C 多克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体 由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的同源抗体。 只是一种或几种 完全是混合的 免疫球蛋白的种类与亚类 一般无。结合到共同决定簇则是完全的 与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉 与其它抗原的交叉反应 无变化 不同批号间有变化 特异性亲和力的重复性 免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇 免疫原的全部成分的全部抗原决定簇 Ag-Ab结合 少， 有 其它血清蛋白 少或几乎无 多 无关的Ig 多 mg/ml 少 μg/ml 抗体含量 单克隆抗体 常规血清抗体 性 质 杂交瘤技术 通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。 单克隆抗体制备过程 1、致敏淋巴细胞的准备 2、骨髓瘤细胞、脾细胞、饲养细 胞的准备。 3、细胞融合 4、选择性培养 5、抗体分泌细胞的筛选 6、克隆化过程 7、单克隆抗体的制取 8、检测 抗原 致敏淋巴细胞 骨髓瘤 细胞 融合 选择性 培养 抗体分泌细胞筛选 克隆化 单抗制取 单抗纯化 单抗鉴定 致敏淋巴细胞的准备 动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式——体内、体外 剂量——0.5-100?g 次数——视抗原而定 间隔——视抗原而定 佐剂——视抗原而定 收集时间：末次接种后72h 骨髓瘤细胞等的准备 1、脾细胞 处死小白鼠——于70％酒精中浸泡消毒——在无菌条件下取脾——1640液中洗脾——镊子轻轻挤压脾做成脾细胞悬液——静置大块的结缔组织下沉——细胞悬液400g离心——沉淀再悬浮——染色显微镜记数活细胞数应高于80％ 细胞融合 方式：物理、化学、生物 PEG融合要点：（见图） 致敏淋巴细胞 骨髓瘤细胞 离心 1000rpm 10min 50%PEG 1ml 培养液 10ml 离心 1000rpm 7min 37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min 加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内 选择性培养 随机融合后的细胞类型 HAT选择培养原理 随机融合后的细胞类型 细胞组合 HGPRT 生长状态 淋巴