高效液相色谱分析讲解课件.pptVIP

用Sep-Pak C18除去杂质 使极性的杂质先流出 中等极性样品流出，保留并分析 小柱及其非极性杂质丢弃 举例：多肽混合物脱盐 小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。 把样品载入小柱 盐等极性物先流出。 用更强(极性更弱)的流动相洗出极性较弱的多肽 用Sep-Pak C18分组分析 样品是一种叫作“Kool-Aid ”葡萄饮料的混合物 步骤∶ 小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。 把样品载入小柱 糖、有机酸等极性物质先流出。 用乙醇/水混合物洗出中等极性的红色染料 蓝色染料仍留在柱子内 最后用100%乙醇洗出极性最弱的蓝色染料 用Sep-Pak C18富集 在分析前浓缩产物到ppm或ppb级 步骤∶ 小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。 把大量(几百毫升)样品载入小柱 溶剂流出 被分析的组份仍保留在柱子内 最后用少量(几毫升)非极性溶剂洗出极性较弱的要分析的组份 习 题 * 1.简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谱带扩张，提高柱效？ 2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留时间为30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流动相，试指出选用哪中溶剂能减少该组分的保留时间？为什么？ 3.为了测定邻氨基苯酚中微量杂质苯胺,现有下列固定相:硅胶,ODS键合相,流动相有:水-甲醇,异丙醚-己烷,应选用哪种固定相,流动相?为什么? 习 题 * 4.在ODS键合相固定相,甲醇-水为流动相时试判断四种苯并二氮杂苯的出现峰顺序.为什么? 5. 在液相色谱中，梯度洗脱最宜于分离(D) A．几何异构体；? ? B．沸点相近，官能团相同的试样；C．沸点相差大的试样；D．分配比变化范围宽的试样。 * 正确答案： * 1：(C)、2：(B)、3：(C)、 4：(D)、5：(B)、6：(A)、7：(C)、 * * * * * * * * * * * 3. 流动相及样品的预处理 液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶ 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长 流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 流动相脱气的方法 加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度 样品的预处理 样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护 样品的预处理重要性 占样品分析时间的比例 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤 样品预处理常用的方法 高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱 其他 样品预处理的过程 去除微粒 过滤 过滤膜/过滤装置 有机(0.5m)/无机(0.45m) 膜片可更换 一次性使用的膜“Cartridge” 使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理 高速离心 大于：10,000g 超滤 机理 超滤是一种基于分子量分离的技术 目的 根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份 除去小分子样品中的大分子蛋白 脱盐 选择性沉淀 常用于生化样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA 样品衍生 提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 典型的例子 氨基酸分析 样品衍生∶氨基酸分析 AccQ-Tag 衍生法 浓缩样品 浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/Sep-Pak小柱 固相萃取（SPE）技术 固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 固相萃取技术（SPE）的重要性 实验室中60~80%的成本及工作量在样品制备上 加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性 Waters的Sep-Pak小柱 Waters专门开发了固相萃取技术（SPE） Sep-Pak小柱的应用领域 除去