活性检测27日.pptxVIP

基因的克隆与表达专题之八 表达产物AKP蛋白的检测关于AKP (E.coli alkaline phosphatase）AKP,大肠杆菌碱性磷酸酶 (大肠杆菌碱性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) 在碱性环境下:水解多种磷酸单酯化合物需要镁和锰离子为激活剂沉降系数(单体)6.0 at pH8.0沉降系数(二聚体)6.2S沉降系数(四聚体)9.6S固有粘度3.4cm3/g电泳迁移率3.3×10-5cm2/V sec at pH7.6等电点pH 4.5等离子点pH 6.3摩擦比率1.05MWw(67-98)×103 at pH8.0MWz(88-99)×103 at pH8.0MWZ+1(86-110)×103 at pH8.0吸光率(278nm for 1mg/ml)0.72激活剂Mg2+，Mn2+，Zn2+，Ca2+抑制剂氰化物, 焦磷酸盐热稳定性85℃加热30分钟仍保留活性，Mg2+存在时可增加酶的热稳定性AKP的理化性质蛋白检测指标根据蛋白的特性活 性纯 度电泳，沉降、晶体衍射等分子量1、质电泳，分子筛，沉降系数等定 性Western，测序等结 构光/色谱，晶体衍射等分光， 凯氏定氮等蛋白浓度获得产量2、量表达产率1、酶活测定：底物显色法AKP＋PipNP （对硝基酚）pNPP（对硝基酚磷酸）黄色无色Na3PO4405nm有特征吸收本实验410nm测定OD值比尔-朗伯定律：ODλ = ?LC εpNP=17500L ·mol-1 · cm-1 C:光吸收物质的浓度（mol·L-1） L:光路长度（cm）1、酶活测定：底物显色法+40μL酶液360μL测活液酶活力单位数＝（其中n为稀释倍数） 30℃反应10min加入3.6ml终止液终止反应于410nm处测定吸光值注:通过调整稀释倍数控制OD410在0.1～0.8之间实验操作一、细胞破碎与制样1. 菌体加入15mL匀浆液2. 超声破碎： 输出功率1200w，超声2秒， 间隔10秒，超声次数：40次3. 粗匀浆制样： 细胞破碎液 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL 90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。4. 匀浆上清制备：另取1.0 mL细胞破碎液，4℃, 12000rpm×10min离心，留上清液5. 上清液制样：匀浆上清 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL ，90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。组别空白零对照空载体表达阴性对照(蓝斑)pETBlue-AKP阳性对照AKP表达粗匀浆上清粗匀浆上清匀浆液（uL）4000000粗匀浆（uL）040400400离心上清（uL活液（uL）360360360360360360室温反应10min终止液（mL）3.63.63.63.63.63.6OD410酶的活力二、AKP酶活性分析谢谢！　2、分子量测定：SDS电泳自然胶电泳；变性胶电泳等电聚焦梯度胶电泳印迹转移电泳双向电泳凝胶电泳的分类：SDS变性胶电泳用途：亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等　PAGE凝胶电泳原理a：丙烯酰胺的量 b：甲叉丙烯酰胺m：溶液的总体积一般按a:b = 29:1 或a:b = 29.2 ：0.8配制储液a+b bT= * 100% C= * 100% m a+bTEMED (加速剂)聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺APS (过硫酸铵,催化剂)　C：表示交联剂所占百分比T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度 改变T值改变胶孔径T分离范围（KD)１５１２－４３１０１６－６８７.５３６－９４５.０ ５７－２１２SDS的 浓 缩 效 应电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成电荷效应：Cl－的快速泳动在其后面形成低电导、高电压梯度区带动Pr－和Gly－快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr－浓缩成狭小薄层SDS的 浓 缩 效 应－Tris-Gly pH 8.3未浓缩的样品浓缩胶 pH 6.8（4%）浓缩后的样品Gly－ 、 Pr－ 、Cl－分离胶 pH 8.8（12%）Tris-Gly pH 8.3＋SDS的变性作用SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开∴ 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质－SDS复合物由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比∴ SDS中，SDS－蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关-分子筛效应实验操作AKP