合成肽pep-rbd通过干扰rap1信号通路抑制人乳腺癌mda-mb-231细胞粘附功能-synthetic peptide pep - rbd inhibits the adhesion function of human breast cancer mda - mbb - 231 cells by interfering with rap 1 signaling pathway.docxVIP

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2018-05-28 发布于上海
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合成肽pep-rbd通过干扰rap1信号通路抑制人乳腺癌mda-mb-231细胞粘附功能-synthetic peptide pep - rbd inhibits the adhesion function of human breast cancer mda - mbb - 231 cells by interfering with rap 1 signaling pathway.docx

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合成肽pep-rbd通过干扰rap1信号通路抑制人乳腺癌mda-mb-231细胞粘附功能-synthetic peptide pep - rbd inhibits the adhesion function of human breast cancer mda - mbb - 231 cells by interfering with rap 1 signaling pathway

AbstractRap1(RasAssociateProtein1)isamemberofRasfamilyofsmallGTPase,whicharesmallcytosolicproteinsthatactlikecellularswitchesandarevitalforeffectivesignaltransduction.Rap1isinactivewheninitsGDP-boundform,andbecomesactivewhenitbindstoGTP.Basedonthepreviousstudies,theRapbindingdomainofRalGDSbindstotheGTP-boundformofRap1withaveryhighaffinity(KD=10nM),theaffinityfortheGDP-boundformisundetectablylow,wehavedesignedseveralpeptides,calledPepN,Pep-RBDandPep-RBD-CPPs-FAM,whichmayhavetheabilitytointerferewithRap1GTP.Theaimofthisstudywasfoundthosepeptides,whichcomefromtheRap1bindingdomainofGuaninenucleotidedissociationstimulator(RalGDS-RBD),whetherornothasabilityforinterferingwithRap1GTP.TheresultofflowcytometershowsthatPep-RBD-CPPs-FAMcanpermeateMDA-MB-231cellmembrane,whencellincubatedwithPep-RBD-CPPs-FAMfor5min.TheresultofGST-RBDassaysuggeststhatthelevelofRap1GTPhasdecreaseddramaticallywhenPep-RBDorPep-RBD-CPPs-FAMfordifferentconcentrationandtimecourse.Surprisely,theresultofGST-RBDassayshowesthatthelevelofRasGTPorRacGTPinMDA-MB-231cellhasnotbeenaffectedbythosepeptides.Furthermore,weshowthatPep-RBDorPep-RBD-CPPs-FAMcaninhibitintegrin-mediatedcelladhesionwithoutalteringcellviability.Insummary,thepeptidePep-RBDcandecreasethelevelofRap1GTPinMDA-MB-231celleffectively.ThisstudyfocusesontheresearchthatPep-RBD-CPPs-FAMandPep-RBDcaninteractwithRap1GTPinMDA-MB-231humanbreastcarcinomacells,whichwillprovideasignificantpreviewtotheresearchofRap1GTPspecificinhibitor.Keywords:Rap1GTP,Pep-RBD-CPPs-FAM,Pep-RBD,CellAdhesion,Ras,Rac目录摘要IAbstractII1绪论1.1Rap1简介(1)1.2Rap1GEFs和GAPs(4)1.3Rap1生理功能与信号通路(6)1.4Rap1在肿瘤发生中的角色(7)1.5本课题的研究目的、内容与意义(8)2核心实验技术与原理2.1蛋白纯化原理(10)2.2蛋白质浓度测定原理(11)2.3GSTPull-down技术(11)2.4变性凝胶电泳与免疫印迹技术(12)2.5流式细胞技术原理(13)2.6共聚焦扫描显微镜的成像原理(14)2.7细胞增殖检测-MTT比色法原理(14)2.8细胞粘附实验原理(14)3材料与方法3.1细胞传代培养实验(16)3.2GST融合蛋白纯化与鉴定(18)3.3细胞总蛋白测定(21)3.4GST-RBDPull-downAssay技术(23)3.5WesternBlot实验(24)3.6免疫印迹—转膜实验(27)3.7流式细胞实验技术(28)3.8激光共聚焦扫描显微镜成像试验—Confocal成像技术(29)3.9细胞增殖检测试验-MTT法(31)4结果与分析合成肽Pep-RBD-CPPs-F