家蚕和果蝇的抗菌肽cecropin b基因的表达及产物抑菌活性分析-expression of cecropin b gene in silkworm and drosophila and analysis of its antibacterial activity.docx

IV IV and so on. BmCecB and BmCecB-EGFP were cloned into baculovirus transfer vector pFastBacI respectively. Two recombinant plasmid pFastBacI-cecB and pFastBacI-cecB-E- GFP were transferred to E.coli competent cells DH10Bac. The recombinant bacmids Bacmid-cecB and Bacmid-cecB-EGFP were obtained. Both bacmid DNA were transfected into silkworm cells mediated by lipofection. The recombinant baculovirus was obtained and transfected into silkworm cells to express. In fluorescence microscopy, green fluorescent transgenic positive cells were observed. Subsequently, the cells were broken by ultrasonic, the results of antimicobial activity showed that of BmCecB has significant antibacterial activity. The results of our study can be used as the basis of the further research. Key words: Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Cecropin B2, Prokaryotic expression, Antibacterial activity, Baculovirus expression vector system, Gene structure VII VII 缩写与符号 BEVS 杆状病毒表达系统 ORF 开放读码框 Bm (Bombyx mori) 家蚕 Dm(Drosophila 果蝇 melanogaster) BmNPV 家蚕核型多角体病毒 RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应 PCR 聚合酶链式反应 GFP 绿色荧光蛋白 FBS 胎牛血清 SDS(Sodium dodecyl sulfate) 十二烷基硫酸钠 PBS 磷酸盐缓冲液 IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖 苷 X-gal 5-溴-4-氯-吲哚-β-D-半 乳糖苷 Agarose 琼脂糖 Amp 氨卞青霉素 Kanamycin 卡那霉素 EB 溴化乙锭 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 DTT 二硫苏糖醇 APS 过硫酸铵 TEMED N，N ’-四甲基乙二胺 EDTA 乙二胺乙酸 PAGE PAGE 10 文献综述 1 抗菌肽简介及研究进展 1.1 抗菌肽简介 抗菌肽(antibacterial peptide，ABP)是生物体内具有免疫屏障作用的一类多肽，是 天然免疫系统中不可缺少的重要组成部分[1]。自 20 世纪 70 年代末 Boman 等[2]首次 在惜古比天蚕（Hyalopbora cecropia）中诱导发现天蚕抗菌肽天蚕素（cecropin）以来， 迄今已有 1 000 多种具有抗菌活性的多肽被分离鉴定，且来源于昆虫的抗菌肽就有 200 多种。 1.1.1 抗菌肽的分类 根据抗菌肽的结构，可将其分为 5 类[3]。 （1）具有螺旋结构的线性多肽，该类多肽抗生素分子量一般在 4KDa 左右，不含 半胱氨酸，但能形成两个两性 α 螺旋，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，多数多肽的 C 端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。此类抗菌肽首先发现于昆虫体内， 以 由 惜 古 比 天 蚕 Hyalopora cecropia 中鉴定的 cecropinA-F 为典型代表[4]。Lee 等人从猪小肠中分高到了 cecropin P1，说明了 cecropins 可能在动物中也广泛存在。 此外，magainins 也是较早发现的一类具有双亲螺旋结构的抗菌肽。 （2）富含某种氨基酸的线性多肽，如 Pro,Trp。从蜜蜂中分离得到的 apidaecins 即是一类富含脯氨酸的多肽抗生素，对某些革兰阴性的植物病原菌和肠杆菌科的致病 菌的高杀伤力，使其在植物抗细菌病基因工程和食品工业中有着很好的应用前景[5]。 （3）含有一个二硫