家蝇rabll基因鉴定及与免疫功能相关性的分析-identification of rab ll gene in musca domestica and its correlation with immune function.docxVIP

摘要摘要Rabll蛋白是一种小GTP酶，定位高尔基体反面网状结构、胞质中的囊泡以及感杆基底等膜系统中，与GTP的结合和水解过程相偶联，在囊泡的出芽、转运、粘附、锚定和融合几个阶段起着重要的作用。作为能够传播多种疾病的病媒昆虫，家蝇Muscadomestica常常生活在病原菌滋生的恶劣环境中，具有很强的适应能力。研究家蝇独特的免疫调控机制，将为了解昆虫生理、免疫以及杀虫等方面提供新的思路。本论文以家蝇为研究对象，研究内容主要分为6个部分。1.通过转录组数据分析、RT-PCR及RACE技术从家蝇幼虫体内克隆获得类似Rabll基因的cDNA序列，经过同源分析，将其命名为MdRabll，并对其氨基酸序列进行了分析。Rabll基因cDNA全长1220bp，包含一个645bp的完整开放阅读框（ORF），根据ORF推导的Rabll肽由214个氨基酸残基组成，经SignalP程序预测此多肽不含有信号肽，理论分于质量为24.29kD，等电点为5.52。同源性分析表明，与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的Rabll相似性最高（identity＝97％）2.通过同源克隆得到家蝇-actin基因，检测了-actin基因作为分于内标的可靠性。家蝇-actin基因cDNA序列全长1380bp，包含一个长度为1056bp的开放阅读框，编码352个氨基酸，经SignalP程序预测此多肽不含有信号肽，理论分于质量为39.53kD，等电点为5.47。该序列与许多物种的序列一致性均高于94％。-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化，且与未经热激处理的对照相比无显著差异，可以作为研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平高低的可靠内部参照标准。3.以家蝇管家基因-actin及GAPDH作为内参分于，利用实时定量RT-qPCR对经大肠杆菌（Escherichiacoli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）刺激，不同组织，家蝇Rabll基因的mRNA表达水平进行定量分析。以基因定量结果显示，菌协迫后家蝇体内Rabll的表达水平发生了显著变化，而且大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别刺激后，Rabll基因的表达变化模式非常相似，都在刺激48h的时候达到高蜂。在家蝇不同组织中，Rabll表达量在肠和血淋巴中较高，其中在血淋巴中的表达量最高；而在表I摘要皮中的表达量较低。4.构建了家蝇Rabll基因的原核表达载体，并在大肠杆菌DE3体内进行诱导表达，并用Rabll蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗血清。5.应用RNA干扰技术，饲喂能够有效抑制虫体中Rabll基因表达的干扰菌，并用针刺法对幼虫进行大肠杆菌（Escherichiacoli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）刺激。在刺激后，与未经Rabll菌体饲喂的家蝇幼虫相比，饲喂组存活率明显降低。6.构建EGFP-Rabll荧光载体，利用细胞转染方法研究其在草地夜蛾细胞中的定位情况。定位结果表明，Rabll基因普遍定位于细胞的膜结构中，这与相关文献报道的Rabll在细胞中的分布相一致。关键词家蝇Rabll先天免疫IIAbstractAbstractRabllisasmallGTPaseimplicatedinmembranetraffic,immunolocalizestothetrans-Golginetwork,cytoplasmicvesicles,andthebaseofrhabdomeresandplaysanimportantroolinthebudding,trasport,tethering,dockingandfusionofthevesicles.Beingapestthatcarrysmanypathogenicorganisms,MuscadomesticaL.（Diptera：Muscidae）livesinandhasadaptswelltotheconditionsthatfullofpathogenicmicroorganisms.Asthehouse?iesareubiquitousandharmfultoourhealth,researchonthehousflyandespeciallyitsuniqueimmunesystemhasbeenconsideredanewguidelinetorevealtheinsectphysiologyandimmunology,andthedevelopmentofthepesticides.Thisthesiscontains6parts.Part1：AnewRabll-likeGTPasewereclonedfromthehouseflybasedondb