家蝇抗真菌肽maf-1原核表达体系优化与活性研究-optimization and activity study of prokaryotic expression system of musca domestica antifungal peptide maf - 1.docxVIP

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2018-05-28 发布于上海
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家蝇抗真菌肽maf-1原核表达体系优化与活性研究-optimization and activity study of prokaryotic expression system of musca domestica antifungal peptide maf - 1.docx

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家蝇抗真菌肽maf-1原核表达体系优化与活性研究-optimization and activity study of prokaryotic expression system of musca domestica antifungal peptide maf - 1

达质粒，并转化至E.coliOrigamiB/(DE3)中获得成功表达，其纯化后的重组MAF-1-LZM具有体外抗真菌活性，其最低抑菌浓度为100μg/ml。结论:1、筛选E.coliOrigamiB/(DE3)为pET-28a(+)-MAF-1重组质粒的较适宜表达宿主菌，在34℃、IPTG终浓度0.025mmol/L、诱导18小时，可获得高效可溶性表达。2、OrigamiB/(DE3)表达体系重组MAF-1体外抗真菌活性较E.coliBL21/(DE3)体系有提高；无凝集活性，无溶血活性；其在胰蛋白酶作用丧失抗真菌活性；其具有耐热、耐冻融特性；His标签对其抗菌活性无显著影响。3、重组融合MAF-1-LZM在E.coliOrigamiB/(DE3)中成功表达，抗真菌实验显示其具有体外抗真菌活性，但MAF-1单体抗真菌活性并未增强。研究结果为进一步的分析MAF-1的功能提供了技术支撑。【关键词】家蝇；MAF-1；蛋白表达；抗真菌活性；大肠杆菌IIIActivityanatysisandprokaryoticexpressionoptimizationantifungalpeptideMAF-1fromMuscadomesticaMajor:PathogenBiologyPostgraduate:ChuanlinPengSupervisor:Prof.JianweiWu[Abstract]Objective：TooptimizetheprokaryoticexpressionsystemofrecombinantpET-28a(+)-MAF-1（Muscadomesticaantifungalpeptide-1）.Method:1.TheexpressionsystemoftherecombinantMAF-1wereconstructedwithEscherichiacoliBL21andE.coliOrigamiB,expressionlevelsofwhichwereanalyzedunderdifferentcultureconditions,includingchangesofculturetemperature,timeandconcentrationofIPTG.TheexpressionrecombinantMAF-1waspurifiedbynickelionmetalchelatingagentaffinitychromatographyanddetectedusingSDSandQuantityOnegelelectrophoresisimageanalysissystem.2.RecombinantMAF-1antifungalactivityinvitroandminimuminhibitoryconcentrationweretestedbymicrodilutiontestusingCandidaalbicansATCC10231asindicatorbacteria,WeobservedtheantifungalactivityoftheexpressiverecombinantMAF-1aftertreatmentwithtrypsin,frozen-thawandheatstress,anddetecteditshemolyticactivityinvitroandagglutinationactivity.AndtheantifungalactivityoftheMAF-1withorwithoutHis-tagwasalsotested.3.WeconstructedfusiongenepET-28a(+)-MAF-1-LZM(lysozymeofMuscadomestica)anditsE.coliOrigamiB/(DE3)expressionsystemusingsynchronousenzymetechnology.Theantifungalactivityofthefusiongenexpressionproductwasdetected.Results:1.BasedontheexpressionsystemoftherecombinantplasmidPET-28a(+)-MAF-1andE.coliOrigamiB/(DE3),thethegrayvalueofrecombinantMAF-1pre-purificationandpurificationwererespectively:808±4,412±2,andtheconcentrationofthepurifiedrecombinantMAF-1was0.706mg/ml,undertheculturecondit