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第八章 发酵工程技术概论 第一节 概 述 一、发酵工程（fermentation engineering）又称微生物工程： 通过微生物完整的细胞自催化完成生物化学反应过程，微生物既能正常生长又能过量积累目的产物，提供工业产品。 包括：抗生素，氨基酸，维生素，有机酸，酶制剂，蛋白质，基因工程药物，核酸类等。 二、发酵工程发展的4个阶段 （1）厌氧发酵的生产过程：如酒精，乳酸等。 （2）好氧（通气）发酵的生产过程：如抗生素、氨基酸、酶制剂等。 第一阶段：天然发酵阶段：传统的酿酒、制酱等。1675年荷兰人列文虎克发明了显微镜。法国巴斯德在1857～1876 持续研究发酵作用。 第二阶段：1900～1940人工控制微生物发酵过程（纯培养阶段 ），新产品酵母，甘油，乳酸，柠檬酸，丙酮和丁醇（第一个工业发酵产品） 第三阶段：通气搅拌技术阶段 （深层通气培养法），1942年青霉素工业化生产，1944年链霉素。 第四阶段：利用基因工程菌进行发酵阶段。 三、发酵工程的研究内容 生产菌种的培养和选育（菌种） 培养基制备（培养基） 发酵条件的优化与控制（搅拌通气，溶氧，发酵过程参数控制，反应器的设计） 产物的分离、提取与精制等（纯化） 菌种 工艺 设备 第二节 优良菌种的选育 一、菌种选育的物质基础 ：DNA 二、自然选育(spontaneous mutation) ：自发突变（正 负） 三、诱变育种 ：人工诱变 四、原生质体融合：基因重组 三、诱变育种 （一）方法和原理 1.诱变机制 （1）微小损伤突变：碱基置换，码组移动 （2）染色体畸变：易位，逆位，缺失，重复 （3）染色体组突变：数目变化（单倍体变多倍体） 2.诱变剂及其作用方式：物理诱变剂，化学诱变剂，生物诱变剂 常用诱变剂 p-263 （二）诱变和筛选 初步筛选是关键步骤 1.自身耐药突变株：耐受自身分泌的抗生素，提高产量 2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株：解除反馈抑制 3.营养缺陷型及其回复突变株 3.营养缺陷型及其回复突变株 通过诱变导致某些基因的突变，而需要添加一些物质（氨基酸、核苷酸等）才能生长的突变体。 营养缺陷型的作用： 解除末端产物的反馈调节作用。 作为标记，在杂交育种中作为出发菌株有利于杂交重组的分析。 作为基因工程的受体菌，检出克隆基因的表达。 诱变包括：出发菌株的选择 诱变剂种类和诱变剂剂量的选择 合理的使用方法 筛选包括：初筛 重复筛选 突变株性能检测 直到获得新的优良菌株。 四、原生质体融合 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 1.一般程序 2.影响融合的因素： 菌龄，培养基成分，PEG,外界因素（高渗溶液，酵母膏） 3.原生质体融合育种：真菌（蘑菇），细菌，植物（马铃薯、草莓、胡萝卜、烟草、矮牵牛、拟南芥、油菜、玉米、水稻、豌豆、甘蔗、柑桔、猕猴桃等） 原生质体融合 目前最成功且至今广为使用的是以PEG作为融合剂，对于所有种类的真菌而言， PEG诱导融合剂条件基本一致： (1) 原生质尽可能的幼嫩； (2) 原生质体要纯； (3) 最适的高渗稳定剂； (4) 用于融合的两菌株原生质体的浓度一般为107，两菌株总量为1∶1； (5) PEG分子量为4000～6000，浓度为25％～40％， (6) pH7～9在Ca2+存在下融合率可进一步提高。 融合子的检出 原生质体融合后，如何筛选融合子，是原生质体技术应用的关键。其方法有： 营养缺陷型互补选择 抗药性选择 灭活原生质体 荧光染色 分子标记选择 还可借助形态标记，自然生态标记等来初判异源融合子。 第三节 发酵的基本过程 一、菌种：0～4℃休眠保存，砂土管1～2年 二、种子的制备 ：摇瓶 种子罐扩大 生产 三、发酵：培养基，发酵罐参数 四、发酵液预处理 五、提取精制 发酵罐参数 温度26～37℃，压力0.3～0.5kg/cm2，搅拌速度，通气量0.3～1m3/m3，接种量5%～20%，pH，培养基体积、粘度、泡沫情况、菌丝形态、溶氧浓度、CO2 含量、总糖、氮、磷、产物含量等。 发酵周期一般2～8d 第四节 发酵方式* 三、连续发酵： 恒化器（基质恒）、恒浊器（菌体密度恒），连续进料出料平衡，保持恒定的发酵液密度。易实现自动化生产，如啤酒，乙醇的发酵。 优点：操作稳定；利于机械、自动化；提高设备的利用率；减少灭菌次数；易于过程优化。 缺点：易染菌；微生物易变异；对产品类型