PCR扩增及相关技术 知识基因与蛋白质工程课件.ppt

§2. PCR扩增及相关技术;I. PCR技术概论 ;一、PCR 历史回顾;直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）, 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。 其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖。 ; 二、 PCR技术的基本原理 ;1、引物设计原则;1、引物设计原则;1、引物设计原则;1、引物设计原则;2、模板与酶;3、dNTP和Mg2+;3、dNTP和Mg2+;4、反应缓冲液;三、PCR反应条件的选择;三、PCR反应条件的选择;六、PCR常见问题与对策;1、无扩增产物;2、非特异性扩增;3、拖尾;4、假阳性;七、RT-PCR;（一）、二步法RT-PCR;加1μl 500μg/ml oligo (dT)15 primer, 涡旋混合，简单离心。 在65 ℃加热混合物10 分钟, 然后室温10 分钟，再分别加入下列试剂：5 × 第一链缓冲液4μl、0.1 M DTT 2μl、10 m M dNTP 1μl 涡旋混合后，简单离心，37℃水浴2 min.。 加2μl 200 U / ml 的M-MLV 反转录酶。轻缓混合，37℃保温1h。其总体积应为20μl。 70 ℃加热15 min 终止反应，然后加20μl 的ddH2O ，cDNA 第一链可作为模板用于PCR 扩增。 若要去除与cDNA 互补的RNA，可加1μl (2 units)的RNase H，然后37 ℃保温20 min。;3、PCR 扩增 在冰上混合加入下列试剂： cDNA 第一链 1μl Taq (5u/1μl) 0.5μl 10 × Taq buffer 5μl dNTP mixture (2mM) 4μl Primer F (10 mM) 2μl Primer R (10 mM) 2μl ddH2O 35.5μl PCR 反应程序 Step 1 94℃ 3min 1 Step 2 94℃ 1min， 60℃ 1min， 72℃ 1min， 30-40 Cycles Step 3 72℃ 5 min 1 Step 4 4℃ forever 以β-actin 作为每个RT-PCR 的内在标准，以水代替反转录酶来检测RT-PCR中的DNA 污染。;（二）、一步法RT-PCR;;4． 将各反应管置于可控温的加热器中，42℃孵育45分钟。 如果热循环仪无热盖功能，则须加入1或2滴（20-40μl）无核酸酶的矿物油覆盖反应体系，以防止反应物浓缩和蒸发。 5．将各反应管直接进入PCR反应。 一般反应条件（仅供参考） ： Step 1 94℃ 2 min Step 2 94℃ 45sec， 60℃ 45sec， 72℃ 1min，30-40 Cycles Step 3 72℃ 5 min 1 Step 4 4℃ forever 6. PCR产物的检测 ;八、实时荧光定量PCR;;Ct 值:;思考题