RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应 生命科学前沿 教学教案.ppt

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR ;RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶 链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA 为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是 总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。 ;提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用OligodT或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。 再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 ;1，RNA提取； 2，RT；RNA-DNA 3，PCR;RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。;一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。 各种组织和细胞中则含有大量内 源性的RNA酶。 另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染； 操作人员的手汗、唾液等; 使用的RNA酶; 器械、玻璃制品、塑料制品。 ;RNA的纯度和完整性分析;实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）  先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中， 其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用， 实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡） （洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC） 试剂配制： 1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在 1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖 ;RNA 引物 Oligo(dT)↓ 混匀，离心，70℃ 5min ↓ 立即冰水浴，稍离心 ↓ M-MLV Buffer dNTP RNasin M-MLV ↓ 混匀，离心，42℃ 60min ↓ 95℃ 10min（破坏MLV） ↓ 4℃保存 ;随机引物;3，PCR反应;RT-PCR反应受多个因素影响， 引物退火的温度，对于具有较高Tm的引物， 增加退火和延伸时的温度 对反应有利； 扩增的循环数，大多数目标RNA经40轮PCR 反应就能观察到。;RT-PCR技术灵敏而且用途广泛， 检测细胞中基因表达水平； 直接克隆特定基因的cDNA序列； 分析基因的转录产物； 获取目的基因； 合成cDNA探针。 ;真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从 DNA PCR得到我们需要的基因呢？;因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为 内含子 （intron），真正编码蛋白的区段是被这些内含子隔开的， 这些编码区叫做外显子（exon）。 真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接， 去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再 翻译成蛋白质。;所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的， 因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。 ;Figure. DNA Contamination in RNA.