不结球白菜wrky转录因子cdna片段的克隆及分析.pdfVIP

蓝苤登王直i±星【过金 1．3 RI-POR 行，以单链eDNA为模板进行PCR扩增。 -TGGCGNAARTAYGGNCARAAR-；W-2 2．0rnmol·L-1 MgCh，0．51．tmol·L．1上下游引物，1U PCR仪上进行。扩增程 Taq酶，反应在PTC．100 4C保存。扩增产物在1．5％琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统进行拍照及分析。 1．4 3’-eDNA末端快速扩增(RAcE) 参照李秋莉等(2002)的方法，根据已获得的白菜WRKY转录因子eDNA片段测序结果， 为53℃，PCR反应体系同上。 1．5目的片段的回收及克隆 GelDNAPurificationkit 目的片段的回收按照TaKaRa生物公司的Agarose Vet．2．0试剂盒的使 18-T载体(TaKaRa)上。连接产物转化感受态 用说明进行。回收的目的DNA片段连接到pMD 进行蓝白斑筛选。 1．6质粒的提取及重组质粒的PCR鉴定 挑取白斑接种于3ml LB(含lOOp,g·L_1Amp)液体培养基中。37C200rpm震荡培养过夜。 参照文献【6】的方法，煮沸法提取质粒。取纯化质粒DNA1皿作为模板，用上述特异引物在相同 条件下进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小。 1．7序列测定及分析 序YfJ钡,U定由上海博亚生物技术公司在ABI377测序仪上进行；相似性比较在NCBI站点上用 BLAST完成。 2结果与分析 2．1 不结球白菜WRKYl基因的RT-PCR扩增 进行PCR扩增，从图1中可以看出，无论是用W-I还是用W-2作为上游引物，均获得了一条约 350bp的单一条带，与预期的片段大小一致。将该片段回收，克隆至载体中，转化大肠杆菌，蓝 自斑筛选，阳性克隆经过测序，得到了两个完全相同的cDNA片段，定名为WRKYl，其长度为 348bp。 图1 不结球白菜WRKYl基因的RT-PCR产物 图23’RACE扩增结果 1．引物W-I与WRKYl8-F的扩增结果： M：DNA分子量； 2．引物W-2与WRKYl8-F的扩增结果． 1．3-RACE扩增结果 RT-PCR ofWRKYlinBrassica Theresultof3’-RACE Fig．1 product geue Fig．2 eampestrisssp．ehlnensis． M：markerDL-2000； M：markerDL-2000；1 1．3’．RACEPCR PCRproductusingprimerW-1 and PCR W-2and WRKYl8-F；2productusingprimer 、ⅣRKYl8．F 2 2 3’一cDNA末端快速扩增 根据已获得的白菜WRKYl片段测序结果，设计一条正向引物W-3 看出，获得了一200bp左右的条带，与预期的片段基本相符。将该片段回收，克隆至 载体中，转化大肠杆菌，经过蓝白斑筛选，阳性克隆的测序结果表明，该片段大小为201bp，与 菜WRKYl基因的3’末端。 2．3不结球白菜WRKYleDNA片段的序列分析 将所获得的两个片段经过拼接，获得了473bp的不结球白菜WRKYI基因的3’末端序列，推 同源性为46～60％。将该序列提交GenBank数据库，登录号为AF518555。 47 嚣墓盆王直牡班过盒 N