MDA 多重置换扩增技术课件.pptxVIP

多重置换扩增（MDA）技术对单细胞基因组测序技术研究进展;基因测序技术;截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法---单分子测序（SMS） ;基因测序技术;单细胞全基因组测序;全基因组扩增技术; 通过MDA扩增DNA;目前单细胞微生物可以通过对多重置换扩增反应（ MDA）得到的扩增DNA进行测序。 在细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微克(10-6g)的高分子量DNA，扩增得到的DNA 适合DNA文库的构建和Sanger测序。MDA生成的DNA也可直接作为模板供焦磷酸测序。 单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强大的工具，它可用于对从环境DNA的提取物（宏基因组序列）得到的多重有机体通过鸟枪法测序来指导构建基因芯片。 ;多重置换扩增（MDA）的示意图： ????????首先随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接下来Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终我们可以获得大量高分子量的DNA.;多重置换扩增 (MDA);多重置换扩增技术（MDA）;;环境样品的处理;分离单细胞;细胞分选;流式细胞仪的测量对象;全基因组扩增(WGA)是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA 的总量。该技术通过对微量组织样本，甚至单个细胞的整个基因组DNA扩增，再将其扩增产物作为模板，进行后续分析，进而完成多位点、多基因以及全基因组DNA 组成的研究。 WGA技术发展至今主要IRS-PCR(interspersed repeat sequence PCR )、LA-PCR(1inker adaptor PCR)、Alu PCR、T-PCR (tagged random primer PCR．T-PCR)、扩增前引物延伸(primer extension preamplification，PEP)和简并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide primer-PCR，DOP-PCR)。但是，由于发生非特异性扩增，位点覆盖不完全，DNA 产物片段小于1 kb等缺点，限制了这些方法的应用。 ;初始模板量分别为：0.1ng,1ng,10ng,100ng，产量均为40μg左右。 ;MDA的应用;基于MDA的单细胞测序 主要研发人：深圳华大基因研究院 技术看点：将多重置换扩增(MDA)和测序技术相结合。 技术简介： 本技术基于多重置换扩增(MDA)，并对该方法的扩增均一性、灵敏度、特异性等方面进行了全面评估。这种将多重置换扩增和测序技术相结合的单细胞测序方法不仅具有更高的分辨率和基因组覆盖度，而且具有更好的敏感性和特异性。该方法从单核苷酸水平上为各种复杂疾病和生物学过程的研究开辟了新思路。 技术论文： Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm Single-Cell Exome Sequencing Reveals Single-Nucleotide Mutation Characteristics of a Kidney Tumor ;MDA的应用;近来对MDA 方法的改进： 减少MDA的反应体积：通过减少污染的扩增DNA和非特异性的合成，如引物二聚体，本质上就是通过消除不必要的反应体积增强特异性的扩增。 通过使用60 nl微流控反应可提高扩增的特异性。 在MDA中，分支的DNA 中间体的形成可导致在一些对初始模板DNA链的延长，然后被置换并对一个不同的模板延长，其结果是形成嵌合体。完整的MDA反应物和S1核酸酶处理后可以消除DNA的单链形式，这可使使嵌合体达到80％的减少。 对嵌合体形成酶路径的了解目前正被用来减少嵌合体的发生。 ;微流控芯片;近日，?Nature出版集团旗下刊物Scientific?Reports刊发南方科技大学副教授贺建奎课题组最新研究成果《单细胞基因组扩增法的定量评估及其在检测单个海马神经元基因拷贝数变异的应用》，从多个角度评估了三种最常用的单细胞基因组扩增方法。经过细致比较发现，MALBAC和GenomePlex?WGA4的方法在拷贝数变异检测方面明显优于MDA方法。 (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles,多重退火和成环循环扩增技术)MALBAC:哈佛大学终身教授