高效液相色谱技术 知识.ppt

高效液相色谱技术（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）;高效液相色谱法 它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论。 以液体作为流动相的色谱法。 在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。 ;HPLC和经典液相色谱法的比较;HPLC vs GC; 特点：高压、高效、高速、高灵敏 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 LC＜＞GC 互补性;结构流程;高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压 输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置 进样系统：进样器，进样阀 分离系统：色谱柱，恒温箱 检测系统：检测器 记录系统：记录装置、色谱工作站;;1、流动相和储液罐;液相色谱的流动相;正相色谱;2. 流动相类别;3. 流动相选择;避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物，含强络合剂的溶液等。;（2）流动相----过滤;溶剂吸滤器: Ni合金，孔约0.45 ?m，防止颗粒物进行泵内。;流动相 在线过滤：;流动相 抽真空过滤;流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 ;常用的脱气方法有： 抽真空脱气法： 特点：可以一次完成过滤和脱气任务 注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系 超声波脱气法 简单，但效果不理想 ;使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天，最好每天更换;主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性;活塞型往复泵 ——液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵 ;;;;双柱塞往复式串联泵示意图;3、梯度洗脱装置：;梯度洗脱装置 梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于GC种使用的程序升温技术  影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类;高压梯度： 用于二???梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器 ;低压梯度： 只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。 ;四元低压梯度系统;四元高压梯度系统;泵压力不正常的主要原因： 气泡，主动阀故障，出口阀故障，密封垫或柱塞杆磨损，渗漏或堵塞，比例阀故障，传感器故障，使用比例阀混合时盐浓度太高;二、进样装置;六通阀进样装置;;六通阀进样装置 正面 ;一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈;六通阀进样装置 反面连接;自动进样器;进样针穿过垫圈进入瓶中;注射器抽取所设定的样品体积;进样针收回;转入针端口使之并成为流路的一部分;进样注意点 进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。 使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。;进样方法 整个定量圈体积进样——为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相。;例20?l定量圈，进样体积不能超过10 ?l。否则，部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关系，样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。 进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。;三、分离系统-色谱柱;色谱柱使用注意点： pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液， 最高操作温度60 ℃，最佳温度 ﹤40℃。 分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。; 柱 pH范围 最高温度;保存色谱柱时用100%甲醇或乙腈，柱两端必须用接头密封。 停用数天后最使用时，应先用低流速甲醇冲洗1h左右，然后再换上流动相，否则直接用流动相，柱效会下降，峰形不好。 新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗（0.5ml/min）。 ;1、要求： 粒径小、颗粒分布均匀 传质快、渗透压小 机械强度高、能耐高压 化学稳定性好;液-固吸附分离固定相; 2. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备